Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phương pháp tách chiết ADN plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và biến tính các phân tử protein. Khi thay đổi pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali acetat, các phân tử protein và ADN hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. ADN plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol. Lượng ARN còn tồn tại trong dung dịch chứa ADN plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase.
Tiến hành:
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 100µl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 200µl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/thể tích: w/v)), đảo nhẹ.
- Thêm 150µl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Bổ sung dung dịch chloroform : isoamyl (24:1) theo tỷ lệ 1:1.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1.5ml mới. - Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút.
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.
- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút. - Làm khô ADN bằng máy Speed-vac 110A, sau đó thêm 50µl nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid có thể được bảo quản ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B trong tế bào vi khuẩn
Escherichia coli chủng BL21(DE3)
Nguyên lý:
E. coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện mang gen mã hóa enzym T7 RNA polymerase trong genome. Khi trong môi trường có IPTG enzym này sẽ được kích hoạt bám vào promoter của vector tái tổ hợp khởi động quá trình dịch mã sản xuất protein SEB. Sau đó, dựa vào tác động vật lý của sóng siêu âm tế bào vỡ ra và giải phóng protein nếu protein ở dạng hòa tan trong tế bào chất.
Tiến hành:
- Nuôi lỏng khuẩn lạc mong muốn trong 10 ml môi trường LB lỏng có kháng sinh ampicillin ở nhiệt độ 37oC, lắc 220 v/p qua đêm.
- Hoạt hóa tế bào: Lấy 0,5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm chuyển sang 10 ml môi trường LB lỏng có kháng sinh như trên, nuôi ở 37o
C, lắc 220 v/p trong 1-2 giờ sao cho OD600 0,4-0,6.
- Cảm ứng bằng IPTG: Bổ sung IPTG ở các nồng độ 1mM vào dịch khuẩn thu được ở bước 2, nuôi lắc 220 v/p trong khoảng thời gian 3 giờ ở các nhiệt độ 37o
C , hoặc 28oC.
- Thu khuẩn lạc vào ống Falcon 50ml, rửa cặn khuẩn bằng dung dịch đệm PBS 1X 3 lần. Bổ sung PBS 1X, hoàn tan tế bào vi khuẩn, ủ trong đá và tiến hành siêu âm tế bào. Sau đó ly tâm 13000 v/p trong 15 phút.
- Định lượng protein thu được ở phần dịch nổi bằng phương pháp Bradford. - Cặn khuẩn được rửa lại bằng dung dịch PBS 1X, sau đó bổ sung hỗ hợp ure 5M và PBS1 X theo tỉ lệ 1:3, hoà tan cặn.
- Protein thu được từ phần dịch nổi và cặn được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE).
2.2.2.9. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Điện di là kĩ thuật được dùng để phân tách các protein dựa trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.
Tiến hành:
Điện di protein được tiến hành trên gel polyacrylamide chuẩn bị với thành phần như sau:
Bảng 2.2. Công thức pha gel tách (12%)
Bảng 2.3. Công thức pha gel cô (5%)
2.2.2.10. Phƣơng pháp tinh sạch protein
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 12 % 10ml dH2O vô trùng 3,3 30% Acrylamid 12 % 4,0 Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 0,375 M 2,5 10% SDS 0,1 % 0,1 10% APS 0,1 % 0,1 TEMED 0,002% 0,004 Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 5 % 3ml dH2O vô trùng 2,1 30% Acrylamid 5 % 0,5 Tris-HCl 1M; pH 6,8 0,13 M 0,38 10% SDS 0,1 % 0,03 10% APS 0,1 % 0,03 TEMED 0,001% 0,003
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyên lý:
Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có đuôi His-tag nên dễ dàng tinh sạch thông qua phương pháp sắc kí ái lực sử dụng cột nikel.
Tiến hành:
Tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 100ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin và cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM trong khoảng thời gian 5 giờ trên máy lắc 220 v/p ở nhiệt độ 28oC.
- Ly tâm 8000 v/p trong 15 phút 400ml dịch khuẩn rồi tiến hành thu cặn. - Thêm 15ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer).
- Ủ trong đá 15phút.
- Tiến hành siêu âm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 20 giây/lần, nghỉ 20 giây trong 1 tiếng 30 phút.
- Chia nhỏ dung dịch ra các ống Eppendorf 2ml rồi tiến hành ly tâm 13000 v/p trong 10 phút rồi thu dịch.
- Phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột ProBond Nickel- Chelating Resin đã chuẩn bị trước.
- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ phòng để protein tái tổ hợp liên kết với Ni++.
- Các protein không có ái lực Ni++ sẽ bị đẩy ra khỏi cột bằng cách rửa cột nhiều lần bằng các đệm thôi (Elution buffer).
- Rửa cột bằng dung dịch đệm rửa (Native wash buffer) với thành phần: 50ml dung dịch đệm tinh sạch (Native purification buffer) (250mM NaH2PO4, pH=8.0, 2,5M NaCl), 335μl dung dịch imidazole 3M, pH 6,0, chuẩn pH 8,0. Rửa cột 3 lần, mỗi lần 3ml.
- Protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng đệm thôi (Native elution buffer) có thành phần 50mM NaH2PO4 pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazole và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1. Kết quả tạo đột biến và nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện
Kết quả tạo đột biến trên gen seb:
Theo những nghiên cứu trước đây, protein SEB được thay thế histidine bằng tyrosine (ngoại trừ phân tử SEB thay thế cả 4 histidine tại 4 vị trí khác nhau trên phân tử SEB bằng tyrosine) vẫn giữ nguyên độc tính không khác SEB chưa được gây đột biến khử độc (wild-type SEB) [22]. Bên cạnh đó, qua kiểm tra khả năng bám dính MHC, Korolev và cs khẳng định việc thay thế 4 tyrosine cho 4 histidine tại 4 vị trí khác nhau trên phân tử SEB không những làm giảm độc tính mà còn không làm mất đi khả năng bám dính của SEB vào HLA DR4,4. Kết quả này 1 năm sau đó đã được khẳng định lại bởi Sarvansky và cs vào năm 2004. Nhóm nghiên cứu đã đưa ra kết luận protein SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằng tyrosine tại các vị trí axit amin 12; 32; 105 và 121 không mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu [31, 22]. Dựa trên những cơ sở khoa học trên, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã thiết kế gen seb đột biến thay thế T bởi C tại các vị trí nucleotide số 37, 97, 316, 369 (tương ứng với thay thế axit amin histidine bằng tyrosine tại vị trí 12; 32; 105 và 121 trên trình tự protein SEB) theo nguyên tắc tạo đột biến điểm bằng phản ứng PCR từ gen
wtseb của chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus S6. Gen seb đột biến sau đó được đưa vào vector tách dòng GS45350 (hình 3.2)
Hình 3.1. Các axit amin sai khác giữa protein SEB đột biến và protein SEB kiểu dại (được đánh dấu màu đỏ). mtSEB: trình tự protein SEB đột biến; wtSEB: trình tự protein SEB kiểu dại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.2. Sơ đồ vector GS45350 mang gen seb đột biến
3.1.1. Thiết kế mồi
Gen seb đột biến được đưa vào vector GS45350 không chứa đoạn mã hóa hai enzym cần thiết cho quá trình kết nối với vector biểu hiện pET21a+ là EcoRI và
HindIII (Hình 3.2.). Chính vì vậy, điểm cắt của hai enzym này được bổ sung bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi chứa hai điểm nhận biết của EcoRI và HindIII. Trình tự mồi này được thiết kế dựa trên trình tự gen seb đột biến với các thông số được thể hiện ở bảng 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350.
Mồi Trình tự mồi Tỉ lệ
G-C (%)
Tm (0C) mSEB - F 5’- GGGGAATTCATGGAGAGTCAACCA - 3’ 50 61.8 mSEB - R 5’- CCCCAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC
TTTTTCTTTG - 3’ 53,7
80.8
Trình tự 2 mồi được thiết kế thêm các điểm cắt của enzym hạn chế EcoRI (GAATTC) và HindIII (AAGCTT) (được kí hiệu đậm và có gạch chân trên bảng 3.1) xuôi chiều với promotor của 2 vector và nằm sát ngay các bộ ba tận cùng của đoạn gen. Hai enzym này sẽ tạo những đầu cắt so le phù hợp tại vector biểu hiện và gen đích, đồng thời làm giảm khả năng tự đóng vòng khi phải mở vòng vector. Vì
EcoRI và HindIII là các enzym hạn chế có hoạt tính mạnh nên cần có 1 trình tự bao ngoài điểm cắt của các enzym. Do đó, trong trình tự mồi chúng tôi thiết kế có trình tự GGG và CCC nằm tại 2 đầu mút của mồi.
Trình tự mồi xuôi còn chứa codon khởi đầu (ATG), trình tự mồi ngược không chỉ có codon kết thúc (TCA) đánh dấu điểm cuối của gen đích mà còn chứa trình tự His-taq (GTG GTG GTG GTG GTG GTG) có ý nghĩa trong quá trình tinh sạch protein đích sau này. Cả 2 mồi đều được thiết kế 1 đoạn trình tự bổ sung với 2 đoạn trình tự đầu và cuối của gen seb tái tổ hợp.
Với thiết kế như trên chúng tôi sẽ nhân được nguyên vẹn chiều dài đoạn gen và giữ đúng khung đọc thông suốt khi đưa vào vector biểu hiện pET21a+ từ vị trí mở đầu trên vector, thông qua đoạn gen seb, 6 axit amin histidine và kết thúc ở bộ ba kết thúc.
3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb
Trên cơ sở nguồn ADN plasmid GS45350 mang gen seb đột biến, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu mSEB- F và mSEB- R để khuếch đại đoạn gen seb mang 4 đột biến với kích thước khoảng 800 bp. Qui trình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tiến hành, thành phần phản ứng và chu kì nhiệt của phản ứng PCR như mục 2.2.2.1. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1 %, kết quả thể hiện như sau:
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB - F và mSEB - R. M: thang ADN chuẩn 1 kb; 1: seb
Kết quả điện di cho thấy: với cặp mồi đặc hiệu mSEB - F và mSEB - R ta thu được đoạn ADN đặc hiệu, rõ nét không có vạch phụ kèm theo , có kích thước khoảng 800 bp đúng theo tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi. Do vậy, sản phẩm PCR này được chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb
Khi thiết kế mồi, chúng tôi đã thiết kế thêm trình tự nhận biết của hai enzym cắt hạn chế EcoRI và HindIII vào hai đầu đoạn gen seb. Do đó, chúng tôi sử dụng chính hai enzym này để tạo đầu cắt so le phù hợp cho đoạn gen thu được sau khi tinh sạch sản phẩm của phản ứng. Thành phần phản ứng cắt seb bằng hai enzym
EcoRI và HindIII như mục 2.2.2.3.
Sản phẩm PCR sau khi được xử bằng hai enzym được tinh sạch theo quy trình của bộ kít “AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer)”. Do trong sản phẩm cắt vẫn có những tạp chất tham gia phản ứng còn dư thừa; vì vậy, để tăng hiệu quả kết nối
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
gen vào vector cần thiết phải tinh sạch sản phẩm c ắt. Tinh sạch ADN là phương pháp thu đoạn ADN tinh khiết dựa trên nguyên lý sử dụng các hạt sepharose để giữ các phân tử ADN đã được gắn với các hạt ion lúc mix sản phẩm cắt trong đệm gắn. Do đó khi chuyển hỗn hợp ADN, enzym, muối chứa trong các đệm .v.v , lên cột phân tách, chỉ có ADN được gắn lên mạng lưới, còn các thành phần khác như protein, muối sẽ bị rửa trôi qua cột. Sau đó, để tách ADN ra khỏi cột người ta sử dụng đệm tách (hoặc nước deion khử trùng để hòa tan ADN). Sau khi tinh sạch tiến hành kiểm tra một lần nữa bằng cách lấy khoảng 5 µl ADN của mẫu đã được tinh sạch ở trên điện di trên gel agarose 1%. Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch được thể hiện trong hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di sản phẩm seb sau tinh sạch. Giếng M: thang ADN chuẩn: 1 kb; Giếng 1: seb
Trên bảng điện di chỉ xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước trong khoảng 750 đến 1000bp, chứng tỏ quy trình tinh sạch ADN đã thành công, đây sẽ là nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu hiện.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến 3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+ 3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+
- Chuẩn bị vector biểu hiện pET21a+
Muốn gen đích biểu hiện thành protein cần thiết kế gen vào vector mang các cấu trúc cần thiết cho quá trình phiên mã và dịch mã. Các vector này được gọi là vector biểu hiện. Các trình tự quan trọng nhất trợ giúp cho quá trình biểu hiện gen đích là: (1) promoter, (2) terminator, (3) trình tự điều hòa (regulator). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng vector pET21a+ là vector biểu hiện.
Vector pET21a+ là vector biểu hiện mạnh có kích thước 5443bp, mang một trình tự T7-taq ở đầu N’ tại vị trí 207 đến 239, và trình tự His-taq ở đầu C’ tại vị trí 140 đến 157. Vector pET21a+ chứa promoter T7 có nhiệm vụ khởi đầu quá trình phiên mã. Trình tự T7-tag và His-tag có chức năng cung cấp điểm khởi đầu dịch mã và kết thúc quá trình dịch mã cũng như tinh sạch protein bằng liên kết ái lực. Vector có gen kháng ampicillin thuận lợi cho quá trình chọn lọc dòng vi khuẩn sau này. Một đặc điểm khác của vector biểu hiện ở mức độ dịch mã so với các vector biểu hiện ở mức độ phiên mã là phải có trình tự rbs (ribosome binding site-vị trí liên kết ribosome) được thiết kế ở giữa vị trí của promoter và đoạn gen được chèn vào. Như vậy, việc biểu hiện protein tái tổ hợp có thể được thực hiện bằng cách xen đoạn ADN đích vào vùng đa tách dòng (Multiple Cloning Site - MCS) của vector biểu hiện.
Để tạo nguồn vector biểu hiện, tiến hành nuôi lỏng chủng E. coli DH5 đã được biến nạp pET21a+ trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicilline 100 mg/l qua đêm ở máy lắc 37oC, 220 v/p. Sau đó tách chiết plasmid pET21a+ như trong mục 2.2.2.7. Điện di 5l plasmid tách được trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả tách chiết plasmid (hình 3.5). Kết quả trên hình 3.5 cho thấy chúng tôi đã tách chiết được plasmid pET21a+ từ chủng E. coli DH5.