Nguyên lý:
Kỹ thuật tổng hợp ADN nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn ADN cần được mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzym ADN polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn ADN chỉ với một lượng nhỏ ADN ban đầu.
Tiến hành:
- Sau khi đo nồng độ ADN khuôn , tính và tạo các nồng độ ADN của các m ẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích ADN khuôn được giống nhau , và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng.
- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn ADN.
- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy. Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:
Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng 16 Dung dịch đệm (10X) 2.5 dNTPs (10mM) 2 Primer mSEB-F (100ng/µl) 1,25 Primer mSEB-R (100ng/µl) 1,25
Taq ADN polymerase hoặc Pfu
turbo ADN polymerase (2.5u/µl ) 1
Vector GS45350/SEB (50 ng/µl) 1 Tổng thể tích 25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1. Chu kì phản ứng PCR