Gen seb trong vector biểu hiện hoạt động dưới sự điều khiển của T7 lac promoter và được kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactoside) có trong môi trường. Do đó, để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có kháng sinh ampicillin và chất cảm ứng IPTG.
Trước khi thực hiện cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, các tế bào vi khuẩn E.coli
BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp cần phải được hoạt hoá bằng cách nuôi lắc ở nhiệt độ 37oC trong môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l cho đến khi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
các tế bào bước vào pha sinh trưởng (OD600 nằm trong khoảng 0,4 đến 0,6). Sau 3 giờ cảm ứng IPTG 1mM ở nhiệt độ 37oC, tiến hành ly tâm 8000 vòng trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Đối với mẫu đối chứng âm, các tế bào E.coli BL21(DE3) chứa plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB và tế bào E.coli BL21(DE3) không chứa plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB cũng được hoạt hóa trên môi trường chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l ở nhiệt độ 37oC cho đến mật độ tế bào thích hợp. Sau đó các tế bào này cũng được biểu hiện ở nhiệt độ 37oC nhưng không bổ sung IPTG ( với đối chứng (-) có vector biểu hiện), và bổ sung 1mM IPTG (với đối chứng (-) không có vector biểu hiện) trước khi thu sinh khối tế bào như trên. Sau đó, chúng tôi tiến hành pha loãng sinh khối tế bào bằng dung dịch đệm PBS 1X và Tween 20 (0,05%), phá vỡ tế bào bằng cách siêu âm khô, thu protein tổng số và chạy điện di protein trên gel polyacrylamide như mục 2.2.2.9 để kiểm tra sự biểu hiện.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của các dòng tế bào mang plasmid pET21a+/SEB tái tổ hợp được trình bày ở hình 3.12.
Hình 3.12. Điện di so sánh protein tổng số của các tế bào E.coli BL21(DE3) mang gen seb tái tổ hợp. M: Thang protein chuẩn (Prestained protein molecular weight marker - Fermentas); 1: Đối chứng âm (protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc BL21(DE3); 2: Protein tổng số trong dịch chết BL21(DE3)/pET21a+/SEB được cảm ứng IPTG; 3: Protein cặn của dòng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB được cảm ứng IPTG; 4: Đối chứng âm (protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc BL21(DE3)/pET21a+/SEB nhưng không được cảm ứng IPTG.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ kết quả trên hình 3.12 cho thấy ở các giếng 2 và 3 vi khuẩn BL21(DE3) mang vector biểu hiện pET21a+/SEB có cảm ứng IPTG xuất hiện một băng protein lạ so với 2 đối chứng âm và có kích thước khoảng 28 kDa tương ứng với kích thước protein SEB theo tính toán lí thuyết. Kết quả này được giải thích là khi có mặt chất cảm ứng IPTG thì lac repressor thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac
operator. Sự loại bỏ lac repressor ra khỏi operator cho phép ARN polymerase bám vào lac promoter và khởi động quá trình phiên mã. Dòng vi khuẩn đối chứng (-) còn lại do không mang vector có gen seb tái tổ hợp nên dù được cảm ứng IPTG giống như với các dòng vi khuẩn mang vector có cảm ứng IPTG cũng không biểu hiện được băng có kích thước như vậy. Năm 2003, Korolev cùng các cs cũng tạo thành công protein SEB không mang đoạn tín hiệu nhưng vẫn hiện diện trong vùng chu chất của tế bào. Trong thí nghiệm đó Korolev và cs, đã sử dụng vector biểu hiện pET22b+ có mang trình tự tín hiệu signal peptide có tác dụng dẫn protein ngoại lai ra vùng khoang chu chất của tế bào biểu hiện [22]. Trong nghiên cứu này, vector pET21a+ không mang trình tự tín hiệu và gen seb tái tổ hợp được thiết kế cũng không có trình tự mã hóa cho đoạn polypeptide đặc biệt này. Do đó, để thu được protein SEB ngoại lai ở dạng tan phù hợp mục tiêu thử hoạt tính kháng nguyên sau này, chúng tôi tiến hành tối ưu các điều kiện biểu hiện gen.