Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 2.1.Sơ đồ các bước thí nghiệm

2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.2.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Nguyên lý:

Kỹ thuật tổng hợp ADN nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn ADN cần được mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzym ADN polymerase. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq ADN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn ADN chỉ với một lượng nhỏ ADN ban đầu.

Tiến hành:

- Sau khi đo nồng độ ADN khuôn , tính và tạo các nồng độ ADN của các m ẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích ADN khuôn được giống nhau , và đạt khoảng 50ng trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng.

- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn ADN.

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy. Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:

Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Nước khử ion vô trùng 16 Dung dịch đệm (10X) 2.5 dNTPs (10mM) 2 Primer mSEB-F (100ng/µl) 1,25 Primer mSEB-R (100ng/µl) 1,25

Taq ADN polymerase hoặc Pfu

turbo ADN polymerase (2.5u/µl ) 1

Vector GS45350/SEB (50 ng/µl) 1 Tổng thể tích 25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.1. Chu kì phản ứng PCR

2.2.2.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Nguyên lý:

Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR cũng dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật PCR, chỉ khác ở mẫu ADN được thay thế bằng ADN plasmid được giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao 94oC đến 95oC, màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu, hoặc mồi vector.

Tiến hành:

Hòa tan tế bào vi khuẩn trong 25µl nước khử ion. Sau đó sử dụng 5µl hỗn hợp này để dùng cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện như mô tả tại mục 2.2.2.1.

2.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế

Nguyên lý:

Enzym hạn chế là các nuclease nội bào (endonuclease) có khả năng nhận biết và cắt các đoạn ADN tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Trong nghiên cứu này hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII được sử dụng với các mục đích bao Bước Phản ứng Nhiệt độ (o

C) Thời gian Chu kì

1 Biến tính 94 3 phút 2 Biến tính 94 30 giây 3 Gắn mồi 55 30 giây 30 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 45 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

gồm: i) để tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng GS45350; ii) để mở vòng vector biểu hiện pET21a+ để sử dụng cho phản ứng kết nối với gen seb; iii) để kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau khi được chuyển vector này. Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và ADN mẫu.

Tiến hành:

Phản ứng cắt mở vòng vector pET21a+ được thực hiện với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)

Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Plasmid pET 21a+ Tổng thể tích 4 1,5 1 1 7,5 15

Phản ứng tạo đầu cắt so le cho gen seb sau khi đã được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector tách dòng GS45350 được thực hiện với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)

Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Sản phẩm PCR Tổng thể tích 12 5 1,5 1,5 30 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các thành phần như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)

Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Vector pET 21a+/SEB Tổng thể tích 2 1 1 1 5 10

Thành phần phản ứng được trộn đều và tiến hành trong 2 giờ ở nhiệt độ 37oC, sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.

2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch ADN từ gel agarose

Nguyên lý:

Phương pháp này được áp dụng để tinh sạch đoạn ADN quan tâm từ bản điện di trên gel agarose. Trong trường hợp này, đoạn gen seb sau khi được nhân bản bằng phản ứng PCR từ vector GS45350 sẽ được tinh sạch để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu. Trong phương pháp này phân tử ADN quan tâm sẽ được giữ lại trên cột tinh sạch có bản chất là các hạt sepharose, sau đó sử dụng đệm để thu lại các phân tử ADN này. Thông qua phương pháp này mẫu ADN sẽ đủ tinh sạch để tiến hành các phản ứng khác như xử lý enzym hạn chế hay kết nối với vector.

Tiến hành:

- Cắt vùng gel chứa đoạn ADN quan tâm trên bản điện di.

- Cân đoạn gel vừa cắt được và xác định thể tích đoạn gel này theo quy ước 1mg trọng lượng sẽ tương đương với 1 µl thể tích.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Bổ sung dịch kết gắn ADN vào cột tinh sạch GB (Gel Binding), theo tỉ lệ: Vmẫu:VGB = 1:3.

- Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 phút thì đảo nhẹ 1 lần cho đến khi gel tan hoàn toàn.

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết ADN và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Tiếp tục bổ sung đệm rửa 500µl WB (Washing Buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm thêm 1 lần nữa trong vòng 1 phút để loại đệm WB.

- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới 1,5ml. Bổ sung 30-50µl nước khử ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1 phút và ly tâm 13000 v/p trong 1 phút để thu mẫu ADN.

2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector

Nguyên lý:

T4 ligase xúc tác tạo liên kết phosphatdieste bằng cách liên kết đầu 5’ phosphat trong phân tử ADN hoặc ARN này với đầu 3’ hydroxyl của phân tử ADN hoặc ARN kia do vậy mà có thể nối 2 sợi ADN hoặc ARN khác nhau. Vector biểu hiện tái tổ hợp được thiết kế bằng cách ghép đoạn gen seb và plasmid pET21a+ sau khi đã xử lý bởi hai enzym giới hạn là EcoRI và HindIII.

Tiến hành:

- Tính nồng độ vector và nồng độ mẫu ADN trong trường hợp nối đầu so le (tỉ lệ về số mol giữa vector : đoạn seb chèn là 1:4)

- Tính các thành phần còn lại cho 1 phản ứng và mix phản ứng.

Phản ứng kết nối đoạn ADN vừa tinh sạch vào vector tách dòng được thực hiện trong hỗn hợp sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nước khử ion Đệm T4 ligase (10X) Gen seb (100ng) Plasmid pET21+ (20ng) Enzym T4 ligase (1u/1µl) Tổng thể tích 2 2 12 2 2 20

Phản ứng kết nối được thực hiện trong 2 giờ ở nhiệt độ 22oC. Sau khi kết thúc, hỗn hợp được dùng để biến nạp hoặc lưu giữ ở tủ -20oC.

2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli DH5α

Nguyên lý:

Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận ADN được gọi là tế bào khả biến. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.

Tiến hành:

- Bổ sung 1µl ADN plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100µl). - Để ổn định trong đá trong vòng 15 phút.

- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.

- Bổ sung 400µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 v/p trong vòng 1giờ, 37oC.

- Cấy trải 100 - 150µl trên môi trường thạch LB chứa ampicillin. - Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm.

2.2.2.7. Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coliDH5α

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Phương pháp tách chiết ADN plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và biến tính các phân tử protein. Khi thay đổi pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali acetat, các phân tử protein và ADN hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. ADN plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol. Lượng ARN còn tồn tại trong dung dịch chứa ADN plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase.

Tiến hành:

- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.

- Thêm 100µl dung dịch Sol I (50 mM gluco, 25 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA (pH 8)), hoà tan cho cặn tan hoàn toàn.

- Bổ sung 200µl dung dịch Sol II (0,2N NaOH; 1% SDS (trọng lượng/thể tích: w/v)), đảo nhẹ.

- Thêm 150µl dung dịch Sol III (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml nước), đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.

- Bổ sung dung dịch chloroform : isoamyl (24:1) theo tỷ lệ 1:1.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1.5ml mới. - Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút.

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu kết tủa.

- Rửa kết tủa 2 lần bằng 500µl ethanol 70%, ly tâm 7000 v/p trong 1 phút. - Làm khô ADN bằng máy Speed-vac 110A, sau đó thêm 50µl nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn. Plasmid có thể được bảo quản ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B trong tế bào vi khuẩn

Escherichia coli chủng BL21(DE3)

Nguyên lý:

E. coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện mang gen mã hóa enzym T7 RNA polymerase trong genome. Khi trong môi trường có IPTG enzym này sẽ được kích hoạt bám vào promoter của vector tái tổ hợp khởi động quá trình dịch mã sản xuất protein SEB. Sau đó, dựa vào tác động vật lý của sóng siêu âm tế bào vỡ ra và giải phóng protein nếu protein ở dạng hòa tan trong tế bào chất.

Tiến hành:

- Nuôi lỏng khuẩn lạc mong muốn trong 10 ml môi trường LB lỏng có kháng sinh ampicillin ở nhiệt độ 37oC, lắc 220 v/p qua đêm.

- Hoạt hóa tế bào: Lấy 0,5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm chuyển sang 10 ml môi trường LB lỏng có kháng sinh như trên, nuôi ở 37o

C, lắc 220 v/p trong 1-2 giờ sao cho OD600 0,4-0,6.

- Cảm ứng bằng IPTG: Bổ sung IPTG ở các nồng độ 1mM vào dịch khuẩn thu được ở bước 2, nuôi lắc 220 v/p trong khoảng thời gian 3 giờ ở các nhiệt độ 37o

C , hoặc 28oC.

- Thu khuẩn lạc vào ống Falcon 50ml, rửa cặn khuẩn bằng dung dịch đệm PBS 1X 3 lần. Bổ sung PBS 1X, hoàn tan tế bào vi khuẩn, ủ trong đá và tiến hành siêu âm tế bào. Sau đó ly tâm 13000 v/p trong 15 phút.

- Định lượng protein thu được ở phần dịch nổi bằng phương pháp Bradford. - Cặn khuẩn được rửa lại bằng dung dịch PBS 1X, sau đó bổ sung hỗ hợp ure 5M và PBS1 X theo tỉ lệ 1:3, hoà tan cặn.

- Protein thu được từ phần dịch nổi và cặn được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE).

2.2.2.9. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Điện di là kĩ thuật được dùng để phân tách các protein dựa trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.

Tiến hành:

Điện di protein được tiến hành trên gel polyacrylamide chuẩn bị với thành phần như sau:

Bảng 2.2. Công thức pha gel tách (12%)

Bảng 2.3. Công thức pha gel cô (5%)

2.2.2.10. Phƣơng pháp tinh sạch protein

Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 12 % 10ml dH2O vô trùng 3,3 30% Acrylamid 12 % 4,0 Tris-HCl 1,5M; pH 8,8 0,375 M 2,5 10% SDS 0,1 % 0,1 10% APS 0,1 % 0,1 TEMED 0,002% 0,004 Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel 5 % 3ml dH2O vô trùng 2,1 30% Acrylamid 5 % 0,5 Tris-HCl 1M; pH 6,8 0,13 M 0,38 10% SDS 0,1 % 0,03 10% APS 0,1 % 0,03 TEMED 0,001% 0,003

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyên lý:

Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có đuôi His-tag nên dễ dàng tinh sạch thông qua phương pháp sắc kí ái lực sử dụng cột nikel.

Tiến hành:

Tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 100ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin và cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM trong khoảng thời gian 5 giờ trên máy lắc 220 v/p ở nhiệt độ 28oC.

- Ly tâm 8000 v/p trong 15 phút 400ml dịch khuẩn rồi tiến hành thu cặn. - Thêm 15ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer).

- Ủ trong đá 15phút.

- Tiến hành siêu âm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 20 giây/lần, nghỉ 20 giây trong 1 tiếng 30 phút.

- Chia nhỏ dung dịch ra các ống Eppendorf 2ml rồi tiến hành ly tâm 13000 v/p trong 10 phút rồi thu dịch.

- Phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột ProBond Nickel- Chelating Resin đã chuẩn bị trước.

- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ phòng để protein tái tổ hợp liên kết với Ni++.

- Các protein không có ái lực Ni++ sẽ bị đẩy ra khỏi cột bằng cách rửa cột nhiều lần bằng các đệm thôi (Elution buffer).

- Rửa cột bằng dung dịch đệm rửa (Native wash buffer) với thành phần: 50ml dung dịch đệm tinh sạch (Native purification buffer) (250mM NaH2PO4, pH=8.0, 2,5M NaCl), 335μl dung dịch imidazole 3M, pH 6,0, chuẩn pH 8,0. Rửa cột 3 lần, mỗi lần 3ml.

- Protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng đệm thôi (Native elution buffer) có thành phần 50mM NaH2PO4 pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazole và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.1. Kết quả tạo đột biến và nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện

Kết quả tạo đột biến trên gen seb:

Theo những nghiên cứu trước đây, protein SEB được thay thế histidine bằng