3.3
Đề tài tiến hành điều tra, thu mẫu keo lai và cây Mỡ bị bệnh tại 3 vƣờn ƣơm sau:
- Vƣờn ƣơm cây rừng, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. - Vƣờn ƣơm cây rừng Công ty giống cây trồng Bắc Nam.
- Vƣờn ƣơm cây rừng Trạm giống vật tƣ lâm nghiệp thuộc Công ty ván dăm Thái Nguyên.
Nghiên cứu giám định sinh vật gây bệnh, phân lập, nuôi cấy mầm bệnh đƣợc tiến hành tại Phòng Nghiên cứu bảo vệ thực vật rừng, viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Hà Nội.
41
3.3
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1 - 2007 đến 12- 2007.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Xác nguyên nhân keo lai cây M .
3.4.2. Điều tra đánh giá tỷ lệ và bị hại đối với keo lai và cây Mỡ.
3.4. hại chủ yếu.
3.4.3.1 Quá trình phát sinh phát triển của bệnh trong năm.
3.4.3.2 Ảnh hƣởng của tuổi cây chủ đến tỷ lệ và mức độ bị bệnh.
3.4.3.3 Ảnh hƣởng của mật độ đến sự phát sinh và phát triển của bệnh.
3.4.3.4 Ảnh hƣởng của chế độ che bóng đến sự phát sinh phát triển của bệnh 3.4.3.5 Ảnh hƣởng của chế độ chăm sóc đến sự phát sinh phát triển của bệnh. 3.4.3.6 Ảnh hƣởng của bệnh đến sinh trƣởng cây chủ.
3.4.4 ết của một số
nấm bệnh gây .
3.4.4.1 í đến tỷ lệ nảy mầm của
nấm gây bệnh.
3.4.4.2. ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tốc độ nảy mầm của ống mầm bào tử.
3.4.4.3. ông khí đến của hệ sợi
nấm gây bệnh.
3.4.4.4. ủa í đến của hệ
sợi nấm gây bệnh.
3.4.4.5. của hệ sợi
42
3.4.5 giải pháp phòng trừ dịch
3.4.5.1. Đề xuất các biện pháp phòng trừ tổng hợp.
3.4.5.2. Xây dựng mô hình phòng trừ tổng hợp bệnh hại keo lai và cây mỡ ở vƣờn ƣơm.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Xác định nguyên nhân gây bệnh - Thu thập mẫu bệnh. - Thu thập mẫu bệnh.
Phƣơng pháp tiến hành là điều tra sơ bộ toàn bộ khu vực bị bệnh. Chọn các mẫu lá, hoặc cành bị bệnh có triệu chứng điển hình cắt và đƣợc gói trong giấy báo. Mẫu bệnh đƣợc đựng trong các túi giấy ghi số mẫu và mô tả một số các đặc điểm của khu vực thu mẫu.Trong quá trình thu thập mẫu lá, thân bị bệnh, bảo quản không bị dập nát.
- Phƣơng pháp mô tả triệu chứng bệnh.
Cần phải xác định bộ phận bị bệnh: lá, thân hay rễ. Mô tả đặc điểm về màu sắc, kích thƣớc của vết bệnh. Sử dụng kính lúp cầm tay có độ phóng đại 10 lần quan sát bề mặt vết bệnh, mô tả màu sắc, hình dạng của thể quả nấm bệnh. Đƣa mẫu lá, thân bị bệnh lên kính hiển vi soi nổi, quan sát các đặc điểm về thể quả nấm bệnh và khối bào tử vô tính (conidial mass) đƣợc phun ra từ thể quả nấm bệnh khi gặp điều kiện ẩm. Sau đó chụp ảnh và ghi số hiệu đối với các mẫu bệnh.
- Giám định nguyên nhân gây bệnh
Với những trƣờng hợp trên lá, thân bệnh chƣa xuất hiện cơ quan sinh sản của nấm bệnh thì ta dùng phƣơng pháp để ẩm của Noumow, vì khi có độ ẩm cao sợi nấm sẽ mọc ra ngoài, tổ chức bị bệnh sẽ hình thành cơ quan sinh sản. Các mẫu lá, cành bị bệnh đƣợc thu thập về, bảo quản mẫu không bị dập nát. Cắt các tổ chức bị bệnh ra thành các đoạn 2 - 3cm cho vào hộp lồng để ẩm. Đặt các hộp lồng ở nhiệt độ 280
43
Để quan sát bào tử của nấm bệnh ta tiến hành nhƣ sau: Nhỏ giọt nƣớc cất lên lam kính, đƣa mẫu lá, thân bị bệnh lên kính soi nổi, dùng que cấy lấy thể quả cho vào lam kính, có nƣớc đậy la men, đƣa mẫu lên kính hiển vi phản pha BX50 có độ phóng đại tối đa 2000 lần để quan sát bào tử nấm bệnh. Trong quá trình quan sát tiến hành mô tả những đặc điểm hình thái về cấu tạo, hình dạng, kích thƣớc, màu sắc bào tử.
Căn cứ vào triệu chứng của bệnh, hình dạng kích thƣớc của thể quả nấm gây bệnh, hình dạng kích thƣớc của bào tử nấm gây bệnh, đối chiếu với các chuyên khảo về vi nấm của Crous P.W., Ferreira, F.A. và Sutton B. 1997; chuyên khảo về nấm túi của Richard T. Hanlin, 1992 .
- Phƣơng pháp phân lập vật gây bệnh
Để có thể phân lập đƣợc VGB ta chuẩn bị môi trƣờng Môi trƣờng PDA Khoai tây: 200 gam
D – Glucose: 20 gam Agar : 18 gam
Nƣớc cất: 1000ml
Khoai tây rửa sạch sau đó cắt thành từng miếng có kích thƣớc ( 1x 1x 1) cm sau đó cho vào nồi và đổ nƣớc 1000ml đun sôi, sau khi sôi để nguội trong 30 phút, lọc lấy nƣớc trong, sau đó cho thêm nƣớc vào vừa đủ 1000ml. Cho D- Glucose và Agar vào các bình tam giác 500ml, nút bông, cuốn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330ml), hấp khử trùng ở môi trƣờng 1210
C (tƣơng đƣơng 1atm) trong 30 phút. Sau đó đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy.
Tiến hành phân lập: Các mẫu thu thập về cắt các tổ chức lá bị bệnh thành các đoạn ngắn 2-3cm, sau đó đặt các mẫu bệnh rửa sạch cho vào hộp lồng để ẩm, sợi nấm mọc từ các tổ chức bị bệnh. Sau khi nấm mọc tiến hành phân lập bằng cách dùng que cấy cấy truyền các mầm bệnh sang môi trƣờng dinh dƣỡng mới. Khi thấy sợi nấm đã mọc tốt, không bị lẫn tạp vớí các loài nấm khác thì đƣợc coi là thuần khiết.
- Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo
Việc gây GBNT giúp cho ta khẳng định đƣợc nấm mà ta phân lập đƣợc từ các tổ chức bị bệnh có chính xác hay không.
44
Phương pháp: Lấy các bào tử từ hệ sợi bằng que cấy đƣợc khử trùng trên ngọn đèn cồn. Pha bào tử trong nƣớc cất vô trùng có mật độ 1 x 106
tế bào/ ml. Nhúng các mẫu lá, thân vào cốc nƣớc dung dịch bào tử, sau đó để vào trong hộp lồng ẩm băng keo lại xung quanh hộp. Mỗi hộp ta để khoảng 2 -3 lá. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 10 hộp lồng, 3 lần lặp, theo dõi thời gian xuất hiện triệu chứng và kiểm tra bào tử trên các lá gây bệnh nhân tạo.
3.5.2. Điều tra đánh giá tỷ lệ và
Phương pháp đánh giá bệnh: Các loài cây ở vƣờn ƣơm thƣờng đƣợc gieo cấy thành hàng, hoặc gieo vãi trên luống. Trên luống gieo tiến hành lập 3 ODB, một ô đầu luống, một ô giữa luống và một ô cuối luống. Diện tích mỗi ODB bằng chiều rộng luống x 1m. Trên ODB điều tra 30 cây theo phƣơng pháp hệ thống, trên luống gieo cách 2 cây điều tra một cây. Cây điều tra đƣợc tiến hành phân cấp bị bệnh, cấp bị bệnh đƣợc chia làm 5 cấp và đánh số từ 0 đến 4:
0 là cây không bị bệnh, 4 là cây bị bệnh ở cấp cao nhất. Chỉ tiêu của từng cấp bệnh nhƣ sau:
Bệnh hại thân cành
Cấp bệnh Chỉ số và biểu hiện của triệu chứng 0 Không bị hại 1 Bị hại <20% thân, cành 2 Bị hại 20 - 50% thân, cành 3 Bị hại 50-70% thân, cành 4 Bị hại > 70% thân cành Bệnh hại lá
Cấp bệnh Chỉ số và biểu hiện của triệu chứng
0 Cành non, lákhông bị bệnh, cây sinh trƣởng phát triển tốt 1 Dƣới 25% diện tích lá bị bệnh hoặc số lá của cây bị bệnh
45
3 50 -75% diện tích lá bị bệnh hoặc số lá của cây bị bệnh 4 > 75% diện tích lá bị bệnh hoặc số lá của cây bị bệnh Từ kết quả phân cấp chỉ số bệnh, tính toán các chỉ tiêu sau:
+ Tỷ lệ bị bệnh: Là phần trăm số cây bị bệnh so với tổng số cây điều tra đƣợc tính theo công thức sau
P = N n x 100 Trong đó: P Tỷ lệ cây bị bệnh (%) n: Số cây bị bệnh
N: Tổng số cây trong điều tra
+ Chỉ số bệnh trung bình: Chỉ số bệnh trung bình đƣợc tính bình quân gia quyền cho từng loại bệnh sau đó tính trung bình cho loài, đƣợc tính theo công thức: R = NV nivi 4 1
Trong đó: R là chỉ số bệnh của từng loại bệnh ni là số cây bị bệnh ở cấp bệnh thứ i vi là trị số của cấp bệnh thứ i
N là tổng số cây điều tra
V là trị số của cấp bệnh cao nhất (4)
- Mức độ bị hại: Mức độ bị hại dựa trên chỉ số bệnh trung bình của từng loại bệnh, mức độ bị hại đƣợc phân làm 5 cấp từ cây khoẻ đến cây bị bệnh rất nặng, với cách tính nhƣ sau:
Chỉ số bệnh trung bình = 0 Cây khoẻ (0)
46
Chỉ số bệnh trung bình: Từ 1,0 đến 2,0 Cây bị bệnh trung bình (++) Chỉ số bị bệnh trung bình: Từ 2,0 đến 3,0 Cây bị bệnh nặng ( +++) Chỉ số bệnh trung bình: Từ 3,0 đến 4,0 Cây bị bệnh rất nặng (++++)
3.5.3. chủ
3.5.3.1. Quá trình phát sinh phát triển của bệnh trong năm.
Lập các ODB có kích thƣớc là 1m2
ở các luống ƣơm cây keo lai và cây Mỡ ở các tháng khác nhau (từ tháng 1 đến tháng 6), mỗi cấp đặt 3 ODB, đầu luống, giữa luống, cuối luống. Trên các ODB tiến hành phân cấp bị bệnh cho các cây trong ô và tính toán tỷ lệ và mức độ bị bệnh.
3.5.3.2. Ảnh hƣởng của tuổi cây chủ đến tỷ lệ và mức độ bị bệnh
Lập các ODB có kích thƣớc là 1m2
ở các luống keo lai và mỡ có tuổi khác nhau, mỗi cấp đặt 3 ODB, đầu luống, giữa luống, cuối luống. Trên các ODB tiến hành phân cấp bị bệnh cho các cây trong ô và tính toán tỷ lệ và mức độ bị bệnh.
3.5.3.3. Ảnh hƣởng của mật độ đến sự phát sinh và phát triển của bệnh.
Lập các ODB có kích thƣớc là 1m2
ở các luống keo lai và mỡ có mật độ xếp cây khác nhau, mỗi cấp đặt 3 ODB, đầu luống, giữa luống, cuối luống. Trên các ODB tiến hành phân cấp bị bệnh cho các cây trong ô và tính toán tỷ lệ và mức độ bị bệnh.
3.5.3.4. Ảnh hƣởng của chế độ che bóng đến sự phát sinh phát triển của bệnh
Lập các ODB có kích thƣớc là 1m2
ở các luống cây keo lai và cây Mỡ có điều kiện che bóng 50% và điều kiện ánh sáng hoàn toàn (không che), mỗi cấp điều tra 3 ODB, đầu luống, giữa luống, cuối luống. Trên các ODB tiến hành phân cấp bị bệnh cho các cây trong ô dạng bản và tính toán tỷ lệ và mức độ bị bệnh.
47
3.5.3.5. Ảnh hƣởng của chế độ chăm sóc đến sự phát sinh phát triển của bệnh.
Lập các ODB có kích thƣớc là 1m2
ở các luống keo lai và mỡ có điều kiện chăm sóc tốt, và không chăm sóc tốt. mỗi cấp đặt 3 ODB, đầu luống, giữa luống, cuối luống. Trên các ODB tiến hành phân cấp bị bệnh cho các cây trong ô và tính toán tỷ lệ và mức độ bị bệnh.
3.5.3.6. Ảnh hƣởng của bệnh đến sinh trƣởng cây chủ
Lập các ODB có kích thƣớc là 1m2
ở các luống keo lai và mỡ b ị bệnh , mỗi cấp đặt 3 ODB, đầu luống, giữa luống, cuối luống. Trên các ODB tiến hành phân cấp bị bệnh cho các cây trong ô và tính toán tỷ lệ và mức độ bị bệnh, đo các chỉ tiêu sinh trƣởng của cây con nhƣ: chiều cao cây, đƣờng kính cổ rễ.
3.5.4 học chủ
3.5.4.1 Nghiên khí đến nảy
Phƣơng pháp đƣợc tiến hành nhƣ sau: Đặt các lam kính có bào tử vào các hộp lồng có để giấy ẩm ở đáy, băng kín lại để ở các nhiệt độ khác nhau trong tủ định ôn 150
C ± 1; 200 C ± 1; 250 C ± 1; 300 C ± 1; 350 C ± 1. Sau những thời gian khác nhau kiểm tra tỷ lệ nảy mầm của bào tử bằng cách đếm trên một lam kính, mỗi hiển vi trƣờng thu thập đƣợc những thông số sau: Tổng số bào tử, số bào tử nảy mầm, thời gian quan sát và thực hiện trên 3 lam kính, mỗi lam kính đo trên 10 hiển vi trƣờng. Cách tính tỷ lệ nảy mầm theo công thức sau: X% = n 1 Xk m 0 Xi x 100 Trong đó : X% là tỷ lệ nảy mầm
Xi là số bào tử nảy mầm trong hiển vi trƣờng thứ i Xk là tổng số bào tử trên hiển trƣờng thứ i đó
48
3.5.4.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tốc độ nảy mầm của ống mầm bào tử
Tốc độ nảy mầm của bào tử đƣợc đo sau những thời gian khác nhau. Mỗi lam kính đo 10 bào tử và thực hiện trên 3 lam kính và lấy giá trị bình quân. Tốc độ nảy mầm của bào tử đƣợc tính theo công thức.
T = L t
1
Trong đó : T là tốc độ nảy mầm của bào tử vô tính t là thời gian
L là chiều dài trung bình của sợi nấm sau thời gian t giờ
3.5.4.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm gây bệnh
Đổ môi trƣờng đã đƣợc hấp khử trùng vào hộp lồng một lớp dày 2- 3mm. Để nguội cho môi trƣờng đông cứng rồi cấy giống nấm vào đĩa thạch bằng que cấy, sau đó băng kín hộp lồng. Xếp các hộp lồng vào tủ định ôn có nhiệt độ 150
C± 1; 200C±1; 250C ± 1; 300C ±1; 350C ±1. Đo đƣờng kính hệ sợi nấm theo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình ở các ngày thí nghiệm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy trị số bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
3.5.4.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng độ ẩm đến sinh trƣởng của hệ sợi nấm gây bệnh
Phƣơng pháp đƣợc tiến hành theo Both.C pha NaCl với nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm để tạo ra môi trƣờng không khí có độ ẩm không khí khác nhau cụ thể nhƣ sau:
NaCL(g/lit) 0 8 16 24 32 40
49
Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để trong tối có nhiệt độ khoảng 23-270C sau 3 ngày trong bình hút ẩm khác nhau sẽ có độ ẩm không khí khác nhau, phụ thuộc vào nồng độ NaCl, khi nồng độ của NaCl càng lớn thì độ ẩm của môi trƣờng càng nhỏ và ngƣợc lại nồng độ NaCL càng nhỏ thì độ ẩm của môi trƣờng càng lớn. Môi trƣờng thạch khoai tây sau khi đƣợc hấp khử trùng đổ vào các hộp lồng đã đƣợc khử trùng một lớp dày 2-3mm. Cấy giống nấm đã đƣợc phân lập vào chính giữa hộp lồng bằng que cấy. Đặt hộp lồng vào các bình hút ẩm có độ ẩm không khí khác nhau, sau thời gian theo dõi ta lấy hộp lồng ra đo đƣờng kính hệ sợi nấm theo hai chiều vuông góc và lấy trị số bình quân. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
3.5.4.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng của hệ sợi nấm gây bệnh
Làm 1 lít môi trƣờng đổ vào 5 bình tam giác. Điều chỉnh pH của môi trƣờng bằng HCL 10% và KOH 10% để có môi trƣờng dinh dƣỡng có trị số pH khác nhau 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0. Sau khi đã điều chỉnh pH trong các bình tam giác, môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 1210
C tƣơng đƣơng 1 atm trong 30 phút. Đổ mỗi môi trƣờng có các mức pH khác nhau vào 10 hộp lồng đã đƣợc khử trùng dày 2-3mm. Sau khi mặt thạch khô, đông cứng tiến hành cấy giống nấm vào chính giữa hộp lồng 1 điểm bằng que cấy, băng kín hộp lồng lại và để vào tủ định ôn 250
C ± 1. Đo đƣờng kính hệ sợi nấm theo hai chiều vuông góc rồi lấy trị số trung bình ở các ngày thí nghiệm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy trị số đƣờng kính khuẩn lạc bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
3.5.5. giải pháp phòng ại
3.5.5.1. Đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh
Các biện pháp phòng trừ tổng hợp đƣợc đề xuất trên cơ sở kết quả nghiên cứu về đặc điểm SVH và STH của nấm gây bệnh. Thử nghiệm thuốc
50
hóa học đƣợc thực hiện trong phòng thí nghiệm và ở vƣờn ƣơm.