III. Đóng góp mới của Đề tài
3.2.2.3. Xác định dạng sống
Chúng tôi mô tả dạng sống của từng loài theo phƣơng pháp của Hoàng Chung (2004) [11].
3.2.2.4. Đánh giá chất lượng cỏ
Chúng tôi lấy lá bánh tẻ của một số loài cỏ ƣu thế của từng điểm nghiên cứu, tiến hành phân tích các chỉ tiêu nƣớc, vật chất khô, prôtêin, đƣờng, lipit và chất xơ.
a. Xác định lượng vật chất khô trong cỏ [35]
- Nội dung:
Sấy mẫu ở nhiệt độ 1050 C đến khi khối lƣợng mẫu không đổi và xác định sự thay đổi khối lƣợng trong quá trình sấy.
- Dụng cụ:
+ Cân phân tích với độ chính xác đến ± 0,0001 gam. + Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ ± 10
C.
+ Hộp nhôm + nắp có đƣờng kính 65 mm, cao 30 mm. + Bình hút ẩm có chứa chất hút ẩm.
- Các bƣớc tiến hành:
Sấy hộp nhôm và nắp ở nhiệt độ 1050
C trong vòng 30 phút, sau đó để nguội trong bình hút ẩm cân chính xác đến 0,0001g.
Mẫu cỏ sau khi mang về phòng thí nghiệm đƣợc cân tƣơi cả túi nilông, lấy cỏ ra phơi khô không khí trong phòng thí nghiệp. Sau một số ngày cân lại, với 3 lần cân có trọng lƣợng không đổi gọi là khô không khí, trọng lƣợng tƣơi của cỏ sẽ là trọng lƣợng lần đầu từ trọng lƣợng túi nilông. Cỏ tƣơi trừ cỏ khô sẽ là lƣợng nƣớc mất đi.
Cân vào hộp nhôm 5g mẫu ở trạng thái khô không khí với độ chính xác 0,0001g. Mở nắp hộp nhôm, đặt nắp xuống đáy của hộp sau đó cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050C) trong vòng 4 giờ tính từ khi nhiệt độ của tủ sấy đạt 1050
C. Sau khi sấy 4 giờ, chúng ta đậy nắp hộp nhôm lại sau đó lấy ra cho vào bình hút ẩm. Sau khi để nguội đem cân bằng cân phân tích. Khối lƣợng hao hụt sau khi sấy đƣợc coi là lƣợng nƣớc, phần còn lại sau khi sấy kiệt gọi là lƣợng vật chất khô.
- Tính toán lƣợng vật chất khô trong mẫu phân tích (S): Đƣợc tính theo công thức phần trăm (%): 100 1 m m S (3.1)
Trong đó: S là lƣợng vật chất khô trong mẫu (%). m1 là khối lƣợng mẫu sau khi sấy ở 1050C. m là khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy ở 1050
b. Xác định hàm lượng nước trong cỏ
Hàm lƣợng nƣớc = 100% - vật chất khô (%)
c. Phương pháp phân tích hàm lượng chất xơ theo Heenerberg-Stohmann [35] Chất xơ đƣợc coi là tổng hợp của nhiều chất nhƣ xenluloze, hemixenluloze, các chất pectin, lignin. Việc định nghĩa chất xơ không dễ dàng, mà thƣờng đƣợc coi là các chất còn lại sau quá trình thuỷ phân.
Chất xơ thô là phần còn lại của các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật sau quá trình thuỷ phân bằng Axít sunfuric và dung dịch Natrihiđroxit.
Chất xơ thực phẩm là phần còn lại của các tế bào thực vật đƣợc phân huỷ bằng các men tiết ra từ các tuyến tiêu hoá. Đó là hỗn hợp xenluloze, hemixenluloze và lignin.
Việc phân tích chất xơ là một phƣơng pháp cổ điển nhƣng luôn luôn là vấn đề cần đƣợc thảo luận thấu đáo. Do quá trình thuỷ phân hoá học các chất trong mẫu phân tích luôn luôn cần một môi trƣờng càng chính xác bao nhiêu càng cho kết quả chính xác bấy nhiêu.
Từ quan điểm trên việc phân tích chất xơ có thể đƣợc tiến hành theo hai cách: Phƣơng pháp hoá học và phƣơng pháp sử dụng enzim. Trong đó, phƣơng pháp phân tích hoá học dùng để phân tích chất xơ là một trong những phƣơng pháp cổ điển nhất của phƣơng pháp phân tích thành phần hoá học có trong thức ăn. Bản chất của phƣơng pháp này xuất phát từ qúa trình thuỷ phân các chất của tế bào thực vật.
- Hoá chất:
+ Dung dịch Axít sunfuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005 N. + Dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N. + Acetone.
- Thiết bị:
+ Thiết bị phân tích xơ ANKOM 200/220. + Túi lọc: Sử dụng túi lọc ANKOM F57.
+ Dụng cụ hàn miệng túi: yêu cầu có nhiệt độ cao đủ để làm chảy nhựa polime trong túi lọc (số hiệu # 1915).
+ Tủ sấy.
- Các bƣớc tiến hành:
+ Đánh dấu túi lọc bằng bút không bị xoá trong dung môi. Cân túi lọc (ghi W1.1) sau đó chỉnh cân về không (ấn phím TARE).
+ Túi đối chứng: Cân ít nhất 1 túi không và cho vào cùng phân tích (ghi W1.2), điều này cho phép xác định sai số xảy ra đối với độ ẩm và khối lƣợng của túi.
+ Cân khoảng 1g mẫu cho thẳng vào túi lọc (ghi W2). Mẫu cân phải cho sát đáy túi. + Hàn miệng túi khoảng 4mm tính từ miệng túi bằng dụng cụ hàn túi. Dàn đều mẫu trong túi bằng lắc hoặc gõ túi. Tránh không để mẫu gần phần hàn miệng túi (trong phạm vi 4mm).
+ Đặt tối đa 24 túi vào khay chứa túi của máy ANKOM. Sử dụng tất cả chín khay mà không quan tâm đến số túi phân tích. Đặt 3 túi vào một khay và xếp các khay vào trục đứng, mỗi cái lệch nhau một góc là 1200. Đặt cả trục chứa các khay mẫu vào buồng phân tích, đặt khối sắt hình trụ lên khay thứ 9 không chứa mẫu để dìm toàn bộ khay xuống.
+ Khi phân tích 24 túi lọc, đổ vào đó 1.900 - 2.000 ml dung dịch axit có nhiệt độ ổn định cho đến khi ngập túi lọc. Nếu phân tích ít hơn 20 túi, cho theo tỉ lệ 100ml axit/ 1 túi (tối thiểu phải có 1.500 ml).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Axít sunfuric (H2SO4) 0,255 ± 0,005N, sau đó rửa nƣớc cất 2 lần (mỗi lần 5 phút).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Natrihiđroxit (NaOH) 0,313 ± 0,005 N, sau đó rửa bằng nƣớc cất tất cả 3 lần.
+ Tháo túi lọc khỏi khay, bóp nhẹ cho bớt nƣớc thừa. Cho túi vào cốc thuỷ tinh thể tích 250 ml, cho thêm acetone ngập túi. Ngâm khoảng 3- 5 phút, lấy túi mẫu ra, nhẹ nhàng bóp để rút bớt acetone.
+ Trải đều túi lọc để khô không khí. Cho vào tủ sấy đặt nhiệt độ 1050C, sấy trong vòng 2 - 4 giờ.
(Chú ý: Không cho túi lọc vào tủ sấy trƣớc khi acetone khô hết).
+ Sau khi sấy khô, lấy túi lọc ra cho vào bình hút ẩm. Để nguội và cân (ghi W3). Tính lƣợng xơ và khoáng của mẫu bằng công thức W4:
W4 = W3 – W1.1
+ Đƣa cả túi đối chứng và túi chứa mẫu vào đốt trong lò nung ở nhiệt độ 5500C trong vòng 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân (ghi W5.1 là khối lƣợng chén + khoáng của mẫu, W5.2 là khối lƣợng chén + bao đối chứng sau đốt).
Tính lƣợng khoáng thực sự của mẫu nhƣ sau:
W5 = (W5.1 – WCM) – (W5.2 – WCĐC) Trong đó: WCM là khối lƣợng chén dùng đốt mẫu.
WCĐC là khối lƣợng chén dùng đốt bao đối chứng.
- Tính toán kết quả:
Hàm lƣợng xơ thô tính bằng % theo công thức sau:
100 2 5 4 W W W X (3.2)
Trong đó: X: Hàm lƣợng xơ thô ( % )
W2: Khối lƣợng mẫu phân tích tính bằng gam
W4: Khối lƣợng chất xơ + khoáng sau khi lọc ete, axit, bazơ và acetone. W5: Khối lƣợng tro của chất xơ sau khi nung
d. Phân tích hàm lượng Protein thô theo phương pháp MicroKjeldanl [9]:
- Nguyên lý:
Trong phƣơng pháp MicroKeldan ngƣời ta vô cơ hoá mẫu bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ ra dạng (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, NH3 sau khi đƣợc giải phóng ra sẽ đƣợc cuốn đi bằng dòng hơi nƣớc nóng. Sau khi đƣợc làm nguội sẽ đƣợc hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 3NH3 + H3BO4 = (NH4)3BO3
Để xác định đƣợc lƣợng amoniac giải phóng ra trong quá trình chƣng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt là đƣợc.
2(NH4)3BO3 + 3H2SO4 → 3(NH4)2SO4 + 2 H3BO3
Từ lƣợng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính đƣợc lƣợng nitơ có trong mẫu.
- Dụng cụ:
Ống công phá mẫu; Bình tam giác 300 ml
- Hoá chất:
H2SO4 đậm đặc 98%; Viên xúc tác Kjeldahl (hỗn hợp Cu và Se); H2SO4 0,1N; NaOH 33%; H3BO3 4% cùng với chất chỉ thị màu Tashio (gồm hỗn hợp xanh Methylen và đỏ Methylen); Nƣớc cất.
- Cách tiến hành:
Giai đoạn công phá mẫu:
+ Bƣớc 1: Cân mẫu:
Mẫu đƣợc xấy khô ở nhiệt độ 50 - 600C, sau đó nghiền nhỏ.
Tiến hành: Cân chính xác và cẩn thận bằng cân phân tích (có độ chính xác 0,0001) 1-1,5 g mẫu cho vào bình công phá (trƣớc khi cho mẫu đã cân vào ống thì ta phải cho vào ống 1 viên xúc tác trƣớc), sau đó cho vào 10 ml H2SO4 đậm đặc, bịt chặt ống đốt mẫu bằng giấy thiếc và ngâm qua đêm.
Chú ý: Để tăng độ chính xác khi phân tích, chúng ta phải bố trí 1 ống Kjeldahl đối chứng chỉ có chất xúc tác và 10 ml H2SO4 đậm đặc mà không có mẫu phân tích, tiến hành tất cả các bƣớc nhƣ mẫu phân tích thật.
+ Bƣớc 2: Công phá mẫu:
Nhiệt độ cần cho quá trình công phá là 3800C, thời gian công phá là 40 phút. Khi quá trình công phá đã đƣợc ta đợi nhiệt độ của ống Kjeldahl hạ xuống bằng nhiệt độ môi trƣờng rồi đƣa vào chƣng cất.
Giai đoạn chưng cất và phân tách amoniac sau khi công phá:
Sau khi công phá xong ta tiến hành chƣng cất trên máy cất đạm tự động Gerhardt. Máy tự động hút dung dịch NaOH, H3BO3 và nƣớc cất. Thời gian chƣng cất là 5 phút dung dịch sau chƣng cất có mầu xanh.
Giai đoạn xác định lƣợng amoniac giải phóng ra sau quá trình chƣng cất: Để xác định đƣợc lƣợng amoniac giải phóng ra trong quá trình chƣng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi nào dung dịch chuyển sang mầu tím nhạt là đƣợc, từ lƣợng axit H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính đƣợc lƣợng đạm có trong mẫu.
- Tính kết quả: Dựa trên lƣợng axit sunphuaric 0,1N tính ra hàm lƣợng prôtein có trong mẫu.
e. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Bertrand [9]:
- Nguyên tắc:
Đƣờng khử do trong cấu trúc có nhóm aldehit có tính khử mạnh nên có khả năng tham gia phản ứng tráng bạc và phản ứng với dung dịch Fehling.
R – CHO + 2AgNO3 + 3NH3 + H2O → R – COONH4 + 2NH4NO3 + 2Ag ↓ R – CHO + 2 Cu(OH)2 → R- COOH + Cu2O ↓ + 2H2O.
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 +2 FeSO4 + H2O
10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5 Fe2(SO4)3 + 8H2O. Khi dùng dung dịch chuẩn KMnO4 0,1N để chuẩn độ lƣợng FeSO4 tạo thành, từ thể tích tiêu tốn khi tra bảng sẽ tìm đƣợc số mg đƣờng khử và áp dụng công thức ta sẽ tìm đƣợc hàm lƣợng đƣờng hay tinh bột trong mẫu.
- Cách tiến hành:
Công đoạn chiết, tách và thuỷ phân: Cân một lƣợng mẫu cỏ sao cho khi pha xong có hàm lƣợng từ 4 -10% đƣờng. Mẫu cỏ đƣợc cắt nhỏ rồi nghiền mịn, sau đó thêm vào khoảng 50ml nƣớc, đun cách thuỷ ở 800C trong 15 phút, để nguội khử tạp chất rồi định mức đến thể tích cần chiết (100 - 150 ml) cả bã, lọc lấy dịch trong. Dung dịch này chỉ phân tích đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử (monosaccarit).
Tiến hành phân tích: Lấy 10ml dung dịch Fehling A và 10 ml dung dịch Fehling B cho vào cốc có dung tích 250cc, đun sôi, thêm 10ml dung dịch phân tích và khoảng 20ml nƣớc sôi. Dung dịch phía trên phải có màu xanh, nếu không phải làm lại với lƣợng dịch lọc ít hơn. Nhƣng tổng thể tích dung dịch cuối cùng trong cốc phải bằng 50ml. Sau lọc kết tủa qua phễu, giữ kết tủa trong cốc, tráng bằng
nƣớc cất sôi một vài lần, sao cho hết màu xanh trên phễu lọc, hoà tan tủa trong cốc bằng 30ml dung dịch Fe2(SO4)3. Lấy bình hứng ra và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 0,1N, đến khi xuất hiện màu hồng.
* Hàm lượng đường khử được tính theo công thức:
A.1000 10. 100 . .G V X(%) (3.3)
Trong đó: X là hàm lƣợng đƣờng khử có trong mẫu (%). V: thể tích dung dịch pha ban đầu
G: mg glucoza A: số gam mẫu cân
10: số ml dung dịch đem phân tích. 1000: hệ số chuyển đổi mg sang gam.
3.2.2.5. Phân tích mẫu đất
- Xác định độ ẩm của đất theo phương pháp sấy khô tuyệt đối: Đất tƣơi sau khi đã đƣợc làm khô không khí (phƣơng pháp nhƣ làm cỏ khô). Cân 100g đất đã hong khô không khí và rây qua rây 1mm cho vào hộp nhôm (mở nắp), sấy trong tủ sấy ở 1050c đến trạng thái không đổi trong thời gian 12 giờ đồng hồ, tiến hành lặp lại ba lần. Sau khi sấy xong, đậy nắp hộp nhôm, cho vào bình hút ẩm (đáy bình chứa CaCl2
hoặc xilicagen) để hạ nhiệt độ cùng với nhiệt độ trong phòng, thông thƣờng để nguội từ 20 - 30 phút, sau đó cân trọng lƣợng đất khô tuyệt đối và so sánh với khối lƣợng ban đầu.
- Xác định độ pH (pH(KCL)) theo phương pháp đo bằng máy pHmeter:
Cho vào bình thủy tinh 5 gam đất đã qua dây 1mm, sau đó thêm vào 25ml KCL (1N), lắc trong 10 phút rồi ngâm qua đêm, lắc lại và đo trên máy Meter đọc trị số pH ở trên máy .
- Xác định hàm lượng mùn (%) theo phương pháp Tiurin: Cân 0,2 gam đất đã qua rây 0,25mm cho vào bình tam giác 100ml, sau đó thêm 5ml dung dịch K2C2r2O7 (0,4N) lắc nhẹ, cắm phễu con trên miệng bình để ngƣng lạnh. Sau đó đặt bình trong nồi Parafin, đun sôi dung dịch trong 5 phút ở nhiệt độ 1700
c - 1800c trên bếp điện cho đến khi dung dịch không còn màu xanh. Để nguội dung dịch rồi đổ vào bình tam giác, dùng nƣớc cất để tráng phễu, bình từ 2- 3 lần và đổ vào bình tam giác. Thêm 1ml H PO và 8 giọt chỉ thị màu Fenylantranyn, sau đó dùng dung dịch
muối Mo chuẩn độ lƣợng Kali bicromat thừa đến lúc dung dịch biến đổi sang màu xanh và tính kết quả.
Để xác định hàm lƣợng đạm, lân, kali cần phải qua giai đoạn công phá mẫu: Cân 1 gam đất đã rây qua rây 1mm cho vào bình thủy tinh dung tích 50ml. Thêm vào bình một ít nƣớc cất để mẫu đất hơi ẩm, rồi cho vào 8ml H2SO4 đặc, lắc đều, cho vào thêm 10 giọt HClO4 70%. Đậy bình bằng một chiếc phễu nhỏ, đun từ từ cho nhiệt độ tăng dần. Khi dung dịch bắt đầu chuyển thành màu trắng thì tiếp tục đun thêm 20 phút nữa. Toàn bộ thời gian công phá mẫu hết khoảng 30 - 40 phút. Sau đó nhấc xuống để nguội cho vào 3 giọt HClO4 và đun cho trắng màu.
- Xác định hàm lượng đạm tổng số (N%) theo phương pháp Kjeldahl: Đem mẫu đất đã đƣợc công phá chƣng cất Kjeldahl với thời gian 20 - 30 phút, thu đƣợc dung dịch màu tím đỏ chuyển sang màu lục và tính kết quả.
- Xác định hàm lượng lân tổng số (P2O5%) theo phương pháp quang phổ hấp phụ: Lấy 5ml dung dịch mẫu sau khi công phá cho vào bình thủy tinh, chỉnh độ pH cho đến 7 bằng dung dịch NaOH 10%, sau đó thêm 10ml dung dịch H2SO4 5N,