a2. MS + 0,5 mg/l NAA b2. MS + 0,5 mg/l NAA a3. MS + 1 mg/l NAA b3. MS + 1 mg/l NAA
3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan của Đài Loan
Trước khi tiến hành khảo sát sự nhân PLB trên hệ thống Plantima, việc vận hành hệ thống này thành thạo hạn chế sự nhiễm là một bước vô cùng quan trọng. Do đó, sau khi được nhập về từ Đài Loan, đọc kỹ các hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và tiến hành lắp ráp hệ thống như hình 1.12.
Sau khi đã lắp các hệ thống như hướng dẫn, tiến hành cài đặt chu kỳ ngập chìm cho hệ thống. Có 3 thông số cần được cài đặt lần lượt là thời gian T1,T2 và T3:
- T1: Thời gian máy bơm được kích hoạt, khí được nén vào ngăn chứa môi trường tạo ra áp suất đẩy môi trường lỏng theo ống dẫn của Funnel lên ngăn chứa mẫu cấy,
- T2: Thời gian máy bơm ngừng hoạt động, van xả khí vẫn đóng giúp áp suất được duy trì để mẫu ngập trong môi trường mà không có sự sục khí,
- T3: Thời gian bơm ngừng hoạt động, van khí mở ra giúp khí ở ngăn chứa môi trường thoát ra ngoài, môi trường từ ngăn trên theo trọng lực chảy xuống ngăn dưới như ban đầu. Khi thời gian T3 kết thúc, hệ thống lặp lại chu kỳ như đã cài đặt.
Khi đã cài đặt các thông số theo ý muốn với T1 = 2 phút, T2 = 30 giây, T3 = 2 giờ, tiến hành cho hệ thống chạy thử với môi trường lỏng được thay bằng nước máy, hệ thống không cần phải khử trùng. Sau một thời gian theo dõi, hệ thống đã vận hành đúng như được lập trình. Việc vận hành hệ thống bước đầu đã thành công.
Tiếp theo sau quá trình vận hành thử hệ thống với môi trường lỏng thay bằng nước máy trong điều kiện không vô trùng, lần này tiến hành pha môi
trường MS bổ sung 30 g/l đường Sucrose, pH 5,8 và cho vào mỗi bình Plantima với thể tích 250 ml theo hướng dẫn của nhà sản xuất, đậy nắp vừa phải, không được chặt quá trước khi hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm, trong 25 phút. Sau khi hấp, đợi hệ thống nguội, siết nắp vừa chặt, dùng film nylon dán kín xung quanh nắp bình Plantima, ráp vào hệ thống và vận hành thử với chế độ ngập chìm là T1 = 2 phút, T2 = 30 giây, T3 = 2 giờ. Hệ thống vận hành bình thường sau 2 – 3 tuần, hiện tượng nhiễm vi sinh vật được quan sát thấy lần lượt trong tất cả các hệ thống bình Plantima.
Các nguyên nhân gây nhiễm trong hệ thống TIS :
- Khi đổ môi trường vào bình trước khi hấp khử trùng theo hướng dẫn, trong quá trình hấp môi trường bị đun sôi văng lên qua chỗ nối với filter làm filter bị ướt, đây có thể là một trong những nguyên nhân gây nhiễm. - Kiểm tra hệ thống nắp và filter có bị rò rỉ trong quá trình bơm hay không bằng cách nhúng bình vào xô nước, nhận thấy dù đã siết nắp thật chặt nhưng vẫn có sự sủi bọt khí ở vị trí nắp và ở filter, điều này chứng tỏ áp suất bơm khí của máy quá mạnh (nguyên nhân là do thử nghiệm chỉ với 8 bình, còn hệ thống bơm được thiết kế cho khoảng 40 bình hoạt động cùng lúc).
Các biện pháp khắc phục hiện tượng nhiễm được thử nghiệm dựa trên việc khắc phục các nguyên nhân dẫn tới nhiễm vi sinh vật:
- Gắn thêm hệ thống điều áp giảm áp suất bơm của máy, cho hệ thống chạy với 20 bình. Thay các ron cao su bị giãn gây hở nắp khi bơm.
- Tiến hành thay ống silicone dài khoảng 10 cm nối hai filter với bình bằng ống silicone dài 25 cm. Môi trường được đổ vào bình trước khi hấp khử trùng, buộc các filter hướng lên trên để tránh hiện tượng môi trường khi hấp bị văng lên filter.
Tiến hành rà soát lại các bước thực hiện, sau hơn 4 tháng tìm hiểu và lặp lại các thí nghiệm khảo sát nguyên nhân gây nhiễm. Hiện tượng nhiễm vi sinh vật trong bình Plantima từng bước đã được khắc phục.
Sau khi khắc phục sự nhiễm của hệ thống, chúng tôi thử nghiệm nuôi cấy với mẫu cấy là các chồi lên từ PLB của Giống Hồ Điệp số 1.
Sử dụng 5 bình TIS mỗi bình chứa 200 ml môi trường MS ½ có bổ sung pepton, dịch chiết khoai tây, nước dừa. Cho vào mỗi bình 30 chồi, và đặt hệ thống bơm hoạt động theo tần xuất cho dung dịch ngập mẫu trong 2 phút, nghỉ 6 giờ. Sau 2 tháng nuôi cấy các chồi trong bình Plantima chúng tôi ghi nhận kết quả như sau: Các chồi được nuôi cấy trong hệ thống này phát triển nhanh và tốt hơn so với các chồi được nuôi trên môi trường đặc (đối chứng). Đặc biệt là các chồi trong bình TIS có hiện tượng nhân chồi tiếp tục, các chồi phát triển với bộ lá lớn hơn và ra rễ sớm hơn, không thấy có hiện tương thủy tinh thể hay dạng bất thường nào.
Hình 3.7. Sự sinh trưởng và phát triển của Lan Hồ Điệp trong bình Plantima