3.1.1.2. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh PLB
Ở 2 giống (Dtps. Taida Salu, giống 1; Dtps. Taida Firebird, giống 2) số lượng PLB tạo ra nhiều nhất nên chúng tôi sử dụng PLB của 2 giống này để thực hiện thí nghiệm.
Mỗi nghiệm thức được nuôi cấy với 3 bình, mỗi bình chứa 10 PLB. PLB được lựa chọn đồng cỡ đều nhau và chưa hình thành chồi, được cắt ngang làm đôi và nuôi cấy trong môi trường MS ½ có bổ sung BA và NAA ở những nồng độ khác nhau, 30 g/l đường sucrose, 15% CW, 1g/l than hoạt tính, 8 g/l agar, pH = 5,9.
Các PLB bị cắt làm đôi tiết rất nhiều phenol nên dễ làm đen mẫu và gây chết mẫu, do đó khi cắt phải chọn lựa những PLB đủ lớn, dùng dao bén để không làm dập mẫu. Dùng acid citric vô trùng để rửa mẫu cắt, làm giảm lượng phenol trên mẫu do vết thương tiết ra.
Sau 8 tuần nuôi cấy ghi nhận kết quả số lượng PLB tạo thành
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân nhanh PLB từ một PLB ban đầu Môi trường NAA -BA (mg/l) PLB tạo thành Giống 1 Tình trạng PLB Giống 1 PLB tạo thành Giống 2 Tình trạng PLB Giống 2 NB1 0,5 - 1 0,77 ± 0,19f Rất ít 1,11 ± 0,38e Ít NB2 0,5 - 2 4,22 ± 0,51d Nhỏ, vàng 3,33 ± 0,58d Vàng xanh NB3 1 - 1 6,77 ± 0,51c Nhỏ, vàng 5,44 ± 0,38c xanh NB4 1 - 2 8,56 ± 0,19b Lớn, vàng xanh 7,21 ± 0,19b xanh NB5 1 - 3 13,9 ± 0,96a Lớn, vàng
xanh 11,5 ± 0,38a xanh
xanh thành
NB7 2 - 1 1,77 ± 0,19e Nhiều chồi 1,11 ± 0,51e Chồi hình thành, có rễ * Ghi chú: Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05.
Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân nhanh PLB từ một PLB ban đầu
Qua đồ thị 3.1 ta thấy ở nghiệm thức NB1 (MS ½ + 0,5mg/l NAA + 1mg/l BA )PLB hình thành rất ít do lượng chất ĐHSTTV chưa đủ để kích thích hình thành PLB ở mẫu bị cắt.
Khi tăng lượng chất ĐHSTTV ở nghiệm thức NB2, NB3 và NB4 thì ta thấy lượng PLB tạo thành từ 2 giống tăng dần.
Ở nghiệm thức NB5 (MS ½ + 1mg/l NAA + 3mg/l BA) cho thấy PLB phát triển tốt ở cả 2 giống (kích thước to có màu xanh nhạt hơi vàng).
Ở nghiệm thức NB7 (MS ½ + 2mg/l NAA + 1mg/l BA) khi tăng lượng NAA lên thì thấy ở PLB có sự hình thành rễ và lượng PLB giảm hẳn, và chồi xuất hiện.
Điều này là do Auxin ở nồng độ thấp (phối hợp với cytokinin) giúp tăng trưởng chồi non và khởi tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô, Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ và cả sự tăng trưởng của rễ này (Bùi Trang Việt, 2000).
Hình 3.2. PLBs và chồi của giống 1 (Dtps. Taida Salu) trên các môi trường MS có nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau
a. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BA.b. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA. b. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA. c. PLBs trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 3 mg/l BA. d. Chồi trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 4 mg/l BA. e. Chồi trên môi trường MS + 2 mg/l NAA + 1 mg/l BA.
Hình 3.3. PLBs và chồi của giống 2 (Dtps. Taida Firebird) trên các môi trường MS có nồng độ chất ĐHSTTV khác nhau
a. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BA.b. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA. b. PLBs trên môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + 2 mg/l BA. c. PLBs trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 3 mg/l BA. d. Chồi trên môi trường MS + 1 mg/l NAA + 4 mg/l BA. e. Chồi trên môi trường MS + 2 mg/l NAA + 1 mg/l BA.
3.1.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB
Để xác định loại đường thích hợp cho sự nhân nhanh PLB của 2 giống số 1 và số 2, cần khảo sát ảnh hưởng của 2 loại đường glucose và sucrose lên sự nhân nhanh PLB trên môi trường MS ½ bổ sung BA 3 mg/l và NAA 1 mg/l, 2 loại đường sucrose và glucose ở các nồng độ khác nhau tùy theo nghiệm thức.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB
Môi trường Sucrose - Glucose (g/l) Số lượng PLB tạo thành của giống 1 Tình trạng PLB giống 1 Số lượng PLB tạo thành của giống 2 Tình trạng PLB giống 2 SG1 30 – 0 13,11 ± 0,38c Chồi 12,00 ± 0,58c Xanh SG2 25 – 5 13,66 ± 0,33c Chồi 12,56 ± 0,38c Xanh SG3 20 – 10 15,44 ± 0,19b Ít chồi 13,88 ± 0,51b Xanh SG4 15 – 15 16,88 ± 0,51a Có nhiều
lông hút 15,44 ± 1,02a Xanh
SG5 10 – 20 13,44 ± 0,19c Vàng 11,56 ± 2,91c Xanh
SG6 5 – 25 5,88 ± 0,84d Vàng 6,80 ± 2,2d Xanh
SG7 0 – 30 5,77 ± 0,96d Vàng 2,33 ± 0,58d Xanh * Ghi chú: Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p= 0,05.
Nghiên cứu của Tokuhara và Masahiro (2003) đã chứng minh ảnh hưởng rất đáng kể của các nguồn carbohydrate khác nhau lên sự hình thành PLB từ huyền phù tế bào của cây Lan Hồ Điệp Doritaenopsis New Toyohashi. Trong nghiên cứu này cho thấy nồng độ đường glucose 58,4 mM cho sự hình thành PLB nhiều nhất sau 8 tuần nuôi cấy. Trong khi đó, trong môi trường chứa maltose có xuất hiện PLB sau 1 tháng nuôi cấy, tuy nhiên lượng PLB rất ít chỉ bằng 8% lượng PLB thu được trên môi trường chứa Glucose. Trường hợp môi trường chứa sorbitol cũng tạo được một ít PLB và callus sau 8 tuần nuôi cấy. Khi nuôi cấy lượng huyền phù tế bào của cây
Doritaenopsis New Toyohashi trên môi trường chứa đường sucrose, callus
hình thành rất nhiều và không có sự xuất hiện của PLB. Dựa vào nghiên cứu trên, thí nghiệm ảnh hưởng của hai loại đường và sự kết hợp của chúng lên sự nhân nhanh PLB được thiết kế, kết quả được nêu trong bảng 3.3.
Khác với kết quả của Tokuhara và Masahiro (2003), ở đây khi sử
dụng chỉ dùng một loại đường glucose trong môi trường nuôi cấy, PLB tạo thành rất ít. Điều này có thể giải thích là do mẫu cấy sử dụng trong thí nghiệm này là PLB chứ không phải là dịch huyền phù tế bào, thêm vào đó yếu tố khác nhau về giống khiến cho kết quả giữa hai nghiên cứu khác nhau như ở trên.
Theo George( 1993), khi sucrose được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nó sẽ bị phân hủy thành 2 loại đường đơn (glucose và fructose) do sự phóng thích của enzyme ngoại bào trong quá trình nuôi cấy in vitro và điều này làm gia tăng áp suất thẩm thấu trong môi trường. Vì vậy cần phải ghi nhận rằng sự khác nhau trong ảnh hưởng của glucose và sucrose lên sự hình thành PLB trong thí nghiệm này có thể không chỉ bởi sự khác nhau về thành
phần đường trong quá trình nuôi cấy mà còn là do sự thay đổi áp suất thẩm thấu do sự phân hủy sucrose thành 2 loại đường đơn.
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB
Mặc dù vậy, khi thay đổi nồng độ đường và sự kết hợp của hai loại đường cho thấy chúng có ảnh hưởng đáng kể lên sự nhân nhanh PLB từ nguồn PLB ban đầu.
Qua đồ thị 3.2 ta thấy sự kết hợp giữa 15 g/l sucrose và 15 g/l glucose cho lượng PLB hình thành là cao nhất. Ở đây dễ dàng nhận thấy sự tương quan giữa nồng độ đường sucrose và glucose đến sự nhân nhanh PLB, khi nồng độ đường sucrose cao nhất và không có glucose, lượng PLB tạo thành khoảng 13,11 PLB.
Tiến hành giảm nhẹ lượng sucrose xuống còn 25 g/l và thêm vào 5 g/l glucose cho thấy có sự tăng nhẹ lượng PLB hình thành. Tiếp tục giảm lượng sucrose và tăng glucose, PLB hình thành tiếp tục gia tăng và đạt mức cao nhất ở nồng độ sucrose 15 g/l và glucose 15 g/l. Tiếp tục giảm sucrose và tăng lượng glucose, sự hình thành PLB giảm dần và thấp nhất ở nồng độ 30 g/l glucose và không có sucrose. Tóm lại, trong thí nghiệm này sự kết hợp
giữa hai loại đường sucrose và glucose cho sự nhân nhanh PLB tốt nhất là ở nồng độ 15 g/l sucrose và 15 g/l glucose.
A B
Hình 3.4. Ảnh hưởng cúa các loại và nồng độ đường khác nhau lên sự nhân nhanh PLBs của giống số 1 và 2 trên môi trường MS ½.