CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3.4. Cách bố trí thí nghiệm
2.3.4.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để vi nhân giống.
+ Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để khởi tạo và nhân nhanh PLB.
Mục đích:
- Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá của các chồi lan Hồ Điệp
- Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh PLB. - Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB.
Phương pháp thí nghiệm:
Xác định nồng độ hormon tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu lá - Tiến hành trên 5 giống, mỗi giống chọn lá cắt nhỏ khoảng 100 mảnh, mỗi mảnh có kích thước 5 x 5 mm.
- Tiến hành cấy trên môi trường MS ½ có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (NAA, Adenin, BA).
Bảng 2.1. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá
Môi trường Nồng độ NAA (mg) Nồng độ adenine (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) MSII1 1 10 0 MSII2 1 0 10 MSII3 1 10 10
Xácđịnh nồng độ hormon tối ưu cho sự nhân nhanh PLB:
- Các mẫu PLB được cắt đôi và cấy vào môi trường MS ½ có bổ sung BA, NAA ở những nồng độ khác nhau; sucrose (30 g/l), CW 15%, CA 1g/l, Agar 8g/l.
- Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mật độ mẫu cấy là 10 mẫu/bình.
Bảng 2.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân PLB
Ký hiệu môi trường
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) NAA BA NB1 0,5 1 NB2 0,5 2 NB3 1 1 NB4 1 2 NB5 1 3 NB6 1 4 NB7 2 1
- Chọn ra tỉ lệ BA và NAA thích hợp nhất tiếp tục thí nghiệm trênnhững nồng độ đường khác nhau với vật liệu là PLB của giống số 1 và giống số 2
Bảng 2.3. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ đường sử dụng lên sự nhân PLB.
Ký hiệu môi trường Sucrose (g/l) Glucose (g/l)
SG1 30 0 SG2 25 5 SG3 20 10 SG4 15 15 SG5 10 20 SG6 5 25 SG7 0 30
Từ kết quả ở thí nghiệm này ta chọn môi trường thích hợp nhất để sử dụng cho tất cả thí nghiệm nhân PLB về sau.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỉ lệ mẫu lá hình thành PLB của 5 giống Hồ Điệp lai sau 8 tuần nuôi cấy.
- Số lượng PLB tạo thành của 2 giống Hồ điệp lai (Dtps. Taida Salu, giống số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) sau 8 tuần nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cũng như trên các môi trường có 2 loại đường ở các nồng độ khác nhau.
+ Thí nghiệm 1.2: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB.
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB Vật liệu: Các PLB của 2 giống Hồ Điệp lai (Dtps. Taida Salu, giống
số 1; Dtps. Taida Firebird, giống số 2) thu được trong thí nghiệm 1.1
Phương pháp thí nghiệm :
- Peptone (2 g/l), CW (15%), PVP (500 mg/l). - Sucrose (20 g/l), khoai tây (30 g/l).
- Agar (8 g/l), CA (1 g/l), pH 5,9.
- Tùy theo nghiệm thức thí nghiệm có bổ sung BA 0; 0,5 và 1 mg/l. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình chứa 10 PLB.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ PLB phát triển thành chồi.
+ Thí nghiệm 1.3: Tìm môi trường thích hợp cho sự ra rễ
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của chồi Lan
Hồ Điệp.
Phương pháp thí nghiệm: Các chồi tái sinh từ PLB được đặt nuôi cấy
trên môi trường MS bổ sung NAA ở nồng độ khác nhau (0; 0,5 và 1 mg/l).
Chỉ tiêu theo dõi:
- Số lượng rễ hình thành - Chiều dài rễ
2.2.3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống Plantima của Đài Loan
Mục đích: Bước đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng, các bước
tiến hành khử trùng dụng cụ và thiết bị nuôi cấy. Tiến hành nuôi cấy thử nghiệm
Phương pháp thí nghiệm: Môi trường MS ½ có bổ sung pepton, dịch
chiết khoai tây, nước dừa
Lắp ráp thiết bị và cho máy vận hành không có mẫu chỉ có môi trường, theo dõi tỉ lệ nhiễm, tìm nguyên nhân và đưa ra các biện pháp khắc phục sự nhiễm của hệ thống.
Sau đó tiến hành thử nghiệm nuôi cấy với mẫu cấy là các chồi lên từ PLB của Giống Hồ Điệp số 1 Dtps. Taida salu. Các bình Plantima chứa thể
tích môi trường 200 ml được sử dụng. Cho vào mỗi bình 20 chồi, và đặt hệ thống bơm hoạt động theo chu kỳ và tần xuất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 2 phút, nghỉ 6 giờ.
2.2.3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima của Đài Loan
Vật liệu: Các cụm PLB của Giống Hồ điệp Số 1 (Dtps. Taida Salu) được sử dụng cho thí nghiệm trong hệ thống Plantima
Môi trường nuôi cấy: MS ½ có bổ sung BA 3mg/l, NAA 1mg/l, nước
dừa 10%, pepton 1g/l và PVP 1g/l, sucrose 15g/l, glucose 15g/l.
+ Thí nghiệm 3.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi trường lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima.
Cho PLB với các mật độ: 2 g, 4 g, 6 g, 8 g vào các bình Plantima có thể tích môi trường 200 ml và cho hệ thống bơm hoạt động theo tần suất định sẵn như bơm cho dung dịch ngập mẫu trong 5 phút, nghỉ 2 giờ.
Từ thí nghiệm về mật độ PLB nuôi cấy chọn mật độ thích hợp nhất cho kết quả nhân PLB tốt và và phát triển đủ không gian bình Plantima để làm thí nghiệm về thể tích môi trường ở các mức : 150 ml, 200 ml và 250 ml. Tần suất ngập chìm là ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 bình Plantima và được lập lại ít nhất 2 lần.
Đối chứng: 1,5 g PLB được nuôi trên môi trường thạch trong các bình tam giác 250 ml có thể tích môi trường là 50 ml.
+ Thí nghiệm 3.2: Khảo sát tần suất ngập chìm của mẫu cấy cấy lên sự nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima
Sử dụng mật độ và thể tích tối ưu trong thí nghiệm 4.1 để khảo sát ảnh hưởng của các tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB: Ngập 10 phút trong chu kỳ 1 giờ; ngập 5 phút trong chu kỳ 2 giờ, ngập 10 phút trong chu kỳ 2 giờ.