Dựa vào tài liệu tham khảo “Giáo trình phân tích thực phẩm” [10], chúng tơi xây dựng quy trình trích ly Vitamin C như sau: Lấy mẫu rau khoảng 25g đem xay trong trong dung dịch đệm KH2PO4 pH = 2,8 để trích ly Vitamin C cĩ trong cải bắp. Sau đĩ tiến hành lọc bằng hệ thống lọc chân khơng. Dịch lọc thu được được định mức lên 100 ml, sau đĩ tiếp tục lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dịch chiết Vitamin C cho phân tích. Dịch thu được tiếp tục pha lỗng 10 lần bằng dung dịch đệm. Sau đĩ tiến hành phân tích với dịch đã pha lỗng này trên máy HPLC. Sơ đồ quy trình trích ly Vitamin C từ cải bắp như hình 3.3 (trang 31).
3.9.2. Khảo sát hiệu suất trích ly đối với quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp
Để cĩ thể tính được hiệu suất thu hồi ta phải thêm lượng chất chuẩn biết trước hàm lượng vào mẫu cần phân tích và cĩ mẫu trắng đối chứng để so sánh.
Cách thức tiến hành: Ở đây chúng tơi khảo sát hiệu suất thu hồi chung của cả quy trình trích và khảo sát sự mất mát riêng của khâu lọc bã và của bã sĩt lại.
Khảo sát độ thu hồi của cả quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp
Chuẩn bị mẫu trích ly: lấy 4 mẫu cải bắp cùng từ một trái, mỗi mẫu cân 25g. Sau đĩ tiến hành xử lý mẫu như sau:
- Mẫu 1: khơng bổ thêm chuẩn Vitamin C
- Mẩu 2: bổ sung thêm 5ml dung dịch chuẩn 1000 ppm Vitamin C vào rau - Mẫu 3: bổ sung thêm 10 ml dung dịch chuẩn 1000 ppm Vitamin C vào rau - Mẫu 4: bổ sung thêm 15 ml dung dịch chuẩn 1000 ppm Vitamin C vào rau.
Hình 3.3:Quy trình trích ly Vitamin C 25g rau Xay Lọc chân khơng Định mức 100mL Siêu lọc Dịch chiết Vitamin C 75 mL dd đệm
Tiến hành trích ly các mẫu đã xử lý trên theo quy trình trích ly như mục 3.9.1 thu được dịch lọc chuẩn bị cho phân tích HPLC. Đồng thời cũng pha lỗng từ dung dịch gốc 1000 ppm thành các dung dịch cĩ nồng độ 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm.
Dịch lọc thu được của các mẫu tiến hành pha lỗng lên 10 lần bằng cách lấy mỗi mẫu dịch 1ml cho vào bình định mức 10 ml và định mức tới vạch bằng dung dịch đệm pH =2,8. Đánh siêu âm các mẫu trước khi phân tích trên máy.
Đo mẫu trên máy HPLC. Mỗi mẫu đo lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình diện tích peak đo được.
Khảo sát sự mất mát Vitamin C trong bã và quá trình lọc.
Lấy 4 mẫu cải bắp mỗi mẫu 50g từ cùng một trái. Sau đĩ tiến hành quy trình trích ly như mục 3.9.1. Dịch lọc thu được sau khi lọc chân khơng tiến hành xử lý như sau:
- Dịch lọc mẫu 1: khơng bổ sung chuẩn Vitamin C
- Dịch lọc mẫu 2: bổ sung thêm 5 ml dung dịch chuẩn Vitamin C - Dịch lọc mẫu 3: bổ sung thêm 10 ml dung dịch chuẩn Vitamin C - Dịch lọc mẫu 4: bổ sung thêm 15 ml dung dịch chuẩn Vitamin C.
Tiếp tục quy trình trích và thu được dịch trích sau siêu lọc qua màng 0,45 µm. Pha lỗng dịch trích mỗi mẫu lên 10 lần, đánh siêu âm tất cả các mẫu và tiến hành phân tích trên máy HPLC. Mỗi mẫu đo lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình diện tích peak đo được.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Kết quả khảo sát phổ hấp thu của Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C:4.1.1. Phổ hấp thu UV của Carbaryl trong nước. 4.1.1. Phổ hấp thu UV của Carbaryl trong nước.
Hình 4.1: Phổ hấp thu UV của dung dịch Carbaryl trong nước
Dựa vào đồ thị phổ hấp thu UV của Carbabyl ở hình 4.1 ta thấy Carbaryl cĩ 2 đỉnh hấp phụ ở bước sĩng 220 và 280 nm. Nhưng ở bước sĩng 220 độ hấp thu đạt được cao hơn. So sánh với kết quả của năm trước kết quả này hồn tồn giống. Như vậy cĩ thể chọn bước sĩng 220 nm để đặt chế độ cho dầu dị UV khi đo Carbabryl của máy HPLC.
4.1.2. Phổ hấp thu UV của Dimethoate trong nước.
Hình 4.2:Phổ hấp thu UV của dung dịch chuẩn Dimethoate trong Axetonitril: nước
Phổ hấp thu của Dimethoat
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 200 220 240 260 280 Bước s ĩng (nm) Đ ộ hấ p th u Phổ hấp thu của carbaryl 0 0.4 0.8 1.2 1.6 200 220 240 260 280 300 320 340 Bước sĩng (nm) Đ ộ hấ p th u
Phổ hấp thu của Dimethoate ở hình 4.2 thu được khi chỉnh pH của dung dịch Dimethoate ở pH = 6. Đồ thị cĩ một đỉnh hấp thu ở bước sĩng 204 nm cho kết quả phù hợp với năm trước. Đồng thời chúng tơi nhận thấy trong quá trình đo quang phổ của Dimethoate trong nước cĩ sự ảnh hưởng lớn của pH dung dịch. Khi chỉnh pH của dung dịch Dimethoate ở giá trị 9 – 10, chúng tơi thấy phổ hấp thu khơng cĩ đỉnh hấp thu cực đại và hình dạng đường phổ dao động zích zắc. Điều này cĩ thể giải thích là ở mội trường pH = 9 -10 mang tính kiềm thì Dimethoate khơng ổn định và bị phân hủy nhanh làm cho giá trị độ hấp thu khi đo dao động nhiều.
4.1.3. Phổ hấp thu UV của Vitamin C trong đệm:
Phổ quét được cho thấy đỉnh hấp thu cưc đại của Vitamin C ở 245 nm, kết quả này hồn tồn phù hợp với tài liệu phân tích Vitamin C của bộ mơn. Như vậy luận văn này cũng đặt giá trị bước sĩng đầu dị UV của máy HPLC là 245 nm khi đo viamin C trong suốt luận văn.
4.2. Kết quả khảo sát pha động đối với Carbaryl và Dimethoate4.2.1. Kết quả khảo sát pha động của Carbaryl: 4.2.1. Kết quả khảo sát pha động của Carbaryl:
Kết quả về diện tích peak và thời gian lưu khi khảo sát các pha động khác nhau cho thấy khi tăng dần lượng Axetonitril lên thì diện tích peak tăng theo và thời gian lưu giảm dần.Điều đĩ chứng tỏ tỉ lệ Axetonitril càng lớn thì khả năng rửa giải của pha động càng cao.Vì Axetonitril là dung mơi phân cực dùng để rửa giải cột pha đảo trong phân tích các chất cĩ độ phân cực trung bình đến mạnh. Luận văn này khảo sát khả năng rửa giải của các pha động và từ đĩ chọn ra pha động phù hợp để tiếp tục khảo sát Carbaryl trong các phần sau luận văn.
Phổ Vitamin C trong dung dịch đệm
-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 210 240 270 300 330 360 390 Bước sĩng (nm) Đ ộ h ấ p t h u
Bảng 4.1: Diện tích peak và thời gian lưu của Carbaryl ở các pha động
Hệ pha động Thời gian lưu trung
bình, phút Diện tích peak trungbình
40/60 11,374 ± 0.038 1270426 ± 60726
55/45 6,291 ± 0.084 1507740,7 ± 7791
70/30 5,502 ± 0,166 1775789,7 ±18823
85/15 3,359 ± 0.806 2016552 ± 52632
Để chọn được một pha động chạy HPLC ta khơng chỉ dựa vào khả năng rửa giải cao mà cịn phải xem xét về thời gian lưu phù hợp.Và cịn tính đến việc tiết kiệm dung mơi sử dụng vì dung mơi chạy HPLC là dung mơi cĩ chí phí đắt. Thời gian lưu chọn phải làm sao khơng quá dài để rút ngắn thời gian phân tích cũng như khơng quá ngắn vì thời gian lưu ngắn dễ trùng với peak dung mơi ra, lúc đĩ diện tích peak đo được sẽ khơng chính xác. Dựa trên Bảng 4.1 ở trên ta thấy pha động với tỉ lệ Axetonitril : nước là 55/45 là cĩ thể chấp nhận được. Nếu tăng tỉ lệ này lên 70/30 thì thời gian lưu giảm xuống khơng đáng kể mà lại tăng lên một lượng khơng ít dung mơi nên chọn pha động này khơng kinh tế lắm.
4.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thành phần pha động phân tích DimethoateBảng 4.2: Diện tích và thời gian lưu của Dimethoate ở các pha động Bảng 4.2: Diện tích và thời gian lưu của Dimethoate ở các pha động
Hệ pha
động Thời gian lưutrung bình, phút Diện tích peak trungbình 40/60 6,549 ± 0,100 184982,3 ± 961,9 55/45 3,973 ± 0,063 219896 ± 7476 70/30 3,654 ± 0,048 342067,7 ± 15324 85/15 2,971 ± 0,004 364542 ± 17498
Tương tự khảo sát pha động của Carbaryl, đối với Dimethoate ta cũng tiến hành khảo sát để chọn ra pha động phù hợp nhất. Dựa trên Bảng 4.2 ta thấy Dimethoate cũng vậy khi tăng tỉ lệ của Axetonitril thì thời gian lưu giảm đồng thời diện tích peak
tăng lên. Ở pha động tỉ lệ 70/30 và 85/15 diện tích peak khá cao so với tỉ lệ 55/45 và 40/60. Nhưng ở pha động 55/45 cho sắc ký đồ cĩ hình dạng cân đối hơn so với các pha động khác. Chúng tơi thấy pha động 55/45 cho thời gian lưu và diện tích peak tương đối trung bình giữa các pha động. Vì luận văn này đồng thời khảo sát đối với hai chất nên chúng tơi chọn pha động chạy Dimethoate cũng là 55/45 để tiện việc phân tích đồng thời cho hai chất. Mục đích là tiết kiệm thời gian khi chuyển từ phân tích chất này sang chất kia vì thời gian thay pha động để phân tích một chất rất lâu mới cĩ thể phân tích ổn định.
4.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C4.3.1. Đường chuẩn của carabryl trong dung dịch nước: 4.3.1. Đường chuẩn của carabryl trong dung dịch nước:
Pha động cho phân tích Carbaryl và Dimethoate dùng là Axetonitril: nước theo tỉ lệ 55/45.
Hình 4.4:Sắc ký đồ đo chuẩn Carbaryl ở nồng độ 10 ppm (a) và 5 ppm (b)
Hình 4.5:Đường chuẩnphân tíchCarbaryl trong nước
y = 185795x R2 = 0,9932 0 1000000 2000000 3000000 4000000 0 5 10 15 20 25 Nồng độ Carbaryl, ppm 6.297 6,198 (a) (b) Diện tích peak
Kết quả đo các mẫu chuẩn của Carbaryl ở các nồng độ cho diện tích peak và thời gian lưu cĩ độ lặp lại tốt, với độ lệch chuẩn chấp nhận được cho sai số thực nghiệm < 5%. Đường chuẩn xây dựng cho khoảng nồng độ từ 1 ppm đến 20 ppm cĩ độ tuyến tính cao với hệ số tương quan R = 0,996.
4.3.2. Đường chuẩn Dimethoate trong dung dịch nước:
Tương tự Carbaryl, đối với Dimthoate kết quả thu được cũng cĩ độ lặp lại cao giữa các lần đo. Đường chuẩn trong khoảng nồng độ đo từ 1ppm đến 20 ppm cĩ độ tuyến tính cao R = 0,997. Ở đây ta thấy thời gian lưu của Dimethoate khoảng gần 4 phút ngắn hơn so với thời gian lưu của Carbaryl là hơn 6 phút cĩ thể giải thích được là do độ phân cực của Dimethoate lớn hơn so với độ phân cực của Carbaryl. Vì vậy pha động sẽ lơi kéo Dimthoate ra nhanh hơn so với Carbaryl.
Hình 4.6:Sắc ký đồ đo chuẩn Dimethoate ở nồng độ 5 ppm (a) và 1 ppm (b)
y = 16006x R2 = 0,995 0 100000 200000 300000 400000 0 5 10 15 20 25 Nồng độ Dimethoat, ppm 3,937 3,968 (a) (b) Diện tích peak
4.3.3. Đường chuẩn dung dịch Vitamin C trong đệm:
Kết quả đường chuẩn của Vitamin C trong khoảng nồng độ đo từ 1 ppm đến 20 ppm như hình 4.7. Sai số giữa các lần đo < 5 % là chấp nhận được, hệ số tuyến tính của đường chuẩn cao R = 0,997.
Hình 4.8:Sắc ký đồ đo chuẩn Vitamin C 1ppm và 2 ppm
Hình 4.9:Đường chuẩn Vitamin C trong dung dịch đệm
Ngưỡng định lượng của máy HPLC
Do hạn chế của phần mềm ứng dụng ghi và xử lý số liệu nên khơng thể tính được giá trị lý thuyết của ngưỡng phát hiện (LOD) và ngưỡng định lượng (LOQ). Giới hạn định lượng (LOQ) của qui trình phân tích cho ba chất trên được xác định qua thực nghiệm bằng cách đo các mẫu chuẩn cĩ nồng độ thấp. Thực nghiệm cho thấy kết quả đo ổn định và cĩ độ lặp lại tốt (cả diện tích peak lẫn thời gian lưu) ở nồng độ 0,1ppm đối với Dimethoate. Cĩ thể lấy đây là ngưỡng định lượng của Dimethoate. Dựa vào hệ số gĩc của đường chuẩn của 3 chất, chúng tơi thấy độ nhạy của máy đối với Carbaryl là lớn nhất rồi tới Vitamin C và Dimethoate. Như vậy dựa vào tỉ số hệ số gĩc đường
y = 29352x R2 = 0,9957 0 100000 200000 300000 400000 500000 0 5 10 15 20 25 Nồng độ Vitamin C, ppm Diện tích peak 2,397 2,397
chuẩn và ngưỡng định lượng của Dimethoate là 0,1 ppm, chúng tơi suy ra được ngưỡng định lượng của Vitamin C là 0,05 ppm và Carbaryl là 0,008 ppm.
4.3. Kết quả độ thu hồi mẫu Carbaryl, Dimthoate và Vitamin C:4.3.1. Độ thu hồi mẫu Dimethoate qua cột: 4.3.1. Độ thu hồi mẫu Dimethoate qua cột:
Phân tích các mẫu Dimethoate cĩ nồng độ 1 – 20ppm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình của diện tích peak và thời gian lưu. Sau đĩ cũng tiếp tục phân tích các mẫu này nhưng để dịng pha động dẫn mẫu thẳng tớí đầu dị, khơng qua cột phân tích. Lấy giá trị trung bình của diện tích peak mẫu khơng qua cột. Tỉ số giữa diện tích peak của mẫu qua cột và mẫu khơng qua cột nồng độ tương ứng là độ thu hồi mẫu qua cột.
Ta cĩ bảng sau:
Bảng 4.3: Độ thu hồi qua cột của Dimethoate:
Mẫu qua cột Mẫu khơng qua cột Độ thu hồi
mẫu qua cột, % Nồng
độ mẫu, ppm
Diện tích peak RSD% Diện tích peak RSD%
1 34538,3 2,48 107228 4,31 32,21 ± 1,57
2 61590,5 3,68 151350 3,24 40,69 ± 1,99
5 163449,5 4,12 253129,8 4,2 64,57 ± 3,74
10 211424,5 3,84 323055,3 3,09 65,45 ± 3,2
20 463938,3 1,51 584562 3,4 79,36 ± 2,93
Tính độ thu hồi theo cơng thức 1 mục 3.6, ta thấy độ thu hồi mẫu qua cột của Dimethoate tăng lên khi tăng nồng độ mẫu. Điều này cĩ thể giải thích là do ở nồng độ thấp một lượng nhỏ Dimethoate bị giữ lại cũng làm ảnh hưởng đáng kể đến kết quả. Nhìn chung thì kết quả độ thu hồi mẫu cũng tương đối cao, chứng tỏ hệ pha động rửa giải Dimethoate khá tốt.
4.3.2. Độ thu hồi qua cột của Carbaryl:
Bảng 4.4: Độ thu hồi qua cột của Carbaryl
Mẫu qua cột Mẫu khơng qua cột
Độ thu hồi mẫu qua cột, % Nồng
độ mẫu,
ppm
Diện tích peak RSD% Diện tích peak RSD%
1 195813,5 4,69 236675 1,55 82,74 ± 4,07 2 313848,8 1,44 372470,8 1,27 84,26 ± 1,61 5 750989,5 3,9 788714,8 1,42 95,22 ± 3,95 10 1512305 0,74 1543244 0,72 98,00 ± 1,00
Độ thu hồi mẫu qua cột của Carbaryl cao hơn rất nhiều so với các mẫu Dimethoate, điều này chứng tỏ hệ pha động Axetonitril/ nước với thành phần 55/45 rửa giải Carbaryl ra khỏi cột tốt hơn nhiều so với rửa giải Dimethoate. Tuy nhiên để thuận tiện trong quá trình thí nghiệm, tạo sự ổn định cho cột phân tích, trong luận văn này chỉ dùng một hệ pha động 55/45 để phân tích cả 2 chất.
4.3.3.Độ thu hồi qua cột của Vitamin C:
Dựa vào kết quả trên bảng 4.5 ta thấy độ thu hồi qua cột của Vitamin C khá cao, tăng dần khi nồng độ mẫu tăng.
Bảng 4.5: Độ thu hồi qua cột của Vitamin C
Mẫu qua cột Mẫu khơng qua cột
Độ thu hồi mẫu qua cột, % Nồng độ
mẫu, ppm
Diện tích peak RSD% Diện tích peak RSD%
1 30427 1,56 35170 2,34 86,51 ± 2,43
2 57752 4,78 65252 4,17 88,51 ± 5,57
5 143544 5,01 157669 1,34 91,04 ± 4,71
10 281456 4,3 302972 2,45 92,9 ± 4,58
4.4. Kết quả khảo sát hiệu suất trích ly dịch Carbaryl và Dimethoate trong nướcqua các bậc trích ly. qua các bậc trích ly.
Theo tài liệu luận văn năm trước quá trình trích ly chỉ tiến hành một bậc và lượng mẫu xử lý nhỏ nên hiệu suất thu hồi từ rau cải bắp của quá chỉ đạt 70,38% đối với Carbaryl và 82% đối với Dimethoate. Vì vậy chúng tơi tiến hành khảo sát thêm số bậc trích ly để đạt được hiệu suất thu hồi mẫu cao hơn. Trước hết chúng tơi khảo sát trên dung dịch chuẩn trong nước của hai chất Carbaryl và Dimethoate để xem số bậc trích ly thực sự ý nghĩa là bao nhiêu.
Sau khi tách pha ta thu được pha hữu cơ và pha nước. Pha hữu cơ tiếp tục được xử