PCR là phƣơng pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA trong ống nghiệm. Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Ngƣời ta còn gọi đó là kỹ thuật tạo dòng DNA invitro. Ngày nay PCR đƣợc dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học.
PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự nhƣ sau :
Bƣớc 1: Biến tính (Denature)
Giai đoạn này đƣợc thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95o
C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách hoàn toàn thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bƣớc 2: Bắt cặp (Annealing)
Phản ứng của primer tác động lên dây nền, các primer này gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để có phân tử DNA mới.
Ở giai đoạn này nhiệt độ đƣợc hạ thấp đến mức cho phép các primer bắt cặp đƣợc với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 – 70oC, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng.
Bƣớc 3: Kéo dài (Extension)
Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ - 3’ của 2 primer nhờ hoạt động của polymerase. Nhiệt độ đƣợc tăng lên 72oC giúp cho DNA
polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Hình 2.1 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR
Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan tâm bằng primer chuyên biệt kết hợp với hoạt động của enzym chịu nhiệt polymerase
nhƣ Taq DNA polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lý. Tác động của primer đƣợc xem nhƣ yếu tố đánh dấu cho hoạt động của polymerase khi nó đƣợc gắn kết vào DNA mạch đơn làm khuôn trong giai đoạn bắt cặp. Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’ - 5’ còn đƣợc gọi là forward primer, kí hiệu là F. Primer bên phải tác động trên dây 5’ - 3’ còn đƣợc gọi là reverse primer, kí hiệu là R. Sự sắp xếp nhƣ vậy đảm bảo vùng bị can thiệp đƣợc tăng cƣờng hoạt động, theo 3 trình tự đã nói ở trên. Tóm lại, khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một khoảng cách đã đƣợc kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ đƣợc khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase.