Ảnh hƣởng của số chu kỳ khuếch đại đến sản phẩm RAPD
Hình 4.3 cho thấy sản phẩm RAPD ở cả hai nghiệm thức đều rất mờ cho thấy số chu kỳ khuếch đại không ảnh huởng nhiều đến sản phẩm RAPD. Nguyên nhân làm cho sản phẩm khuếch đại ít là do thành phần phản ứng RAPD chƣa phù hợp. Vì vậy, chúng tôi quyết định giữ nguyên số chu kỳ khuếch đại là 45 chu kỳ và tiến hành tối ƣu hóa các thành phần phản ứng RAPD.
Hình 4.3 Khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ
Chú thích: 1, 2, 3: số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức; TB: loài lan Thái Bình (Bảo Lộc).
Ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD
Primers là yếu tố ảnh hƣởng mạnh nhất đến sự thành công hay thất bại của phản ứng PCR. Hình 4.4 cho thấy, cả bốn nghiệm thức đều cho sản phẩm RAPD, trong đó nghiệm thức 4 cho sản phẩm RAPD với số lƣợng băng nhiều và rõ nhất. Các nghiệm thức còn lại cho sản phẩm không đồng đều, điều này có thể do thao tác PCR chƣa tốt. Theo nhƣ kết quả khảo sát, chúng tôi chọn nồng độ primer tối ƣu cho phản ứng RAPD là 0,6 µM nhằm đảm bảo hiệu quả về kinh tế.
Hình 4.4 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer
Chú thích: 1, 2, 3: số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức; TB: loài lan Long Nhãn (Bảo Lộc).
Ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+
đến sản phẩm RAPD
Nồng độ Mg2+cũng là một trong những nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Hình 4.5 cho thấy, cả ba nghiệm thức đều cho sản phẩm RAPD, trong đó nghiệm thức 3 cho sản phẩm RAPD với số lƣợng băng nhiều và rõ nhất. Các nghiệm thức còn lại cho sản phẩm không đồng đều, điều này có thể do thao tác PCR chƣa tốt. Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ Mg2+ tối ƣu cho phản ứng RAPD là 2 mM nhằm đảm bảo hiệu quả kinh tế.
Hình 4.5 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Mg2+
Ảnh hƣởng của nồng độ Taqpolymerase đến sản phẩm RAPD
Nồng độ Taq quá thấp sẽ không đủ lƣợng enzyme để xúc tác tạo sản phẩm nhƣ mong muốn. Ngƣợc lại, nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên tính, gây sai lệch kết quả. Qua kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy nghiệm thức 1 cho sản phẩm RAPD hơi mờ, trong khi sản phẩm RAPD ở nghiệm thức 3 lại chứa nhiều tạp. Vì vậy, chúng tôi chọn nồng độ Taq tối ƣu cho phản ứng RAPD là 1U.
Ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD
Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ DNA mẫu ở 3 nghiệm thức không ảnh hƣởng nhiều đến phản ứng RAPD. Chúng tôi nhận thấy nồng độ DNA mẫu 50 ng/µl là tối ƣu cho phản ứng ứng RAPD.
Hình 4.7 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu Ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm RAPD
Trong phản ứng PCR, mối tƣơng quan giữa nồng độ Mg2+, dNTPs và Taq
đóng vai trò rất quan trọng. Ở nghiệm thức 3, 4 tƣơng ứng với nồng độ dNTPs là 0,3 mM và 0,4 mM (xem hình 4.8), sản phẩm PCR là rất ít. Đặc biệt, ở nghiệm thức 4 sản phẩm khuếch đại không xuất hiện. Điều này xảy ra là do khi sử dụng dNTPs ở nồng độ cao sẽ làm mất đi một lƣợng lớn Mg2+ tự do mà Mg2+ đóng vai trò là cofactor cho Taq polymerase hoạt động nên khi Taq polymerase hoat động kém hiệu quả cũng có nghĩa là sản phẩm PCR sẽ giảm đi. Nếu sử dụng dNTPs với nồng độ quá cao thì sẽ không có sản phẩm khuếch đại. Kết quả khảo sát cho thấy nghiệm thức với nồng độ dNTPs là 0,2 mM là tối ƣu cho phản ứng RAPD.
Sau khi tối ƣu hóa phản ứng PCR với marker RAPD, chúng tôi đƣa ra thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng và chƣơng trình nhiệt tối ƣu nhƣ sau:
Bảng 4.2 Nồng độ tối ƣu của các thành phần trong phản ứng PCR Hóa chất Nồng độ sử dụng PCR buffer MgCl2 dNTP Primer Taq polymerase DNA mẫu H2O 1X 2 mM 0,2 mM 0,6 M 1U 50 ng Thêm vừa đủ 25 l
Bảng 4.3 Chƣơng trình nhiệt tối ƣu cho phản ứng PCR Số chu kỳ Nhiệt độ (0 C) Thời gian (phút) 1 94 5 45 94 30 Ta 30 72 1 1 72 5 Hold 40C