Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng do các ƣu điểm sau:
Độ nhạy rất cao Thao tác đơn giản.
Thời gian thực hiện nhanh.
Độ tinh sạch của mẫu không cần cao. Lƣợng mẫu cần ít.
Tuy nhiên, phƣơng pháp này có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng nhƣ khi phân tích kết quả. Có thể có ba vấn đề lớn khi sử dụng kỹ thuật PCR:
Trong thực nghiệm, kích thƣớc của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên.
Trừ vài trƣờng hợp rất cá biệt, phƣơng pháp PCR không hoạt động đƣợc với những đoạn DNA lớn hơn 3000 bp. Việc sử dụng PCR với các độ dài dƣới 1500 bp cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ƣu cho phản ứng phải đƣợc xác định qua thực nghiệm.
Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phƣơng pháp này.
Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trƣớc. Khi mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại, các phân tử khuếch đại sẽ thoát ra khỏi ống nghiệm và lơ lửng trong không gian phòng thí nghiệm rồi
nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện pháp sau:
Các công đoạn thao tác khác nhau phải tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
Dụng cụ dùng để thực hiện phản ứng (micropipette không sử dụng vào các thao tác khác).
Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trƣớc.
Tất cả mọi thành phần phản ứng đều chia thành những lƣợng nhỏ đủ với 1, 2 lần thao tác.
Hạn chế các sai sót gây ra do Taq polymerase: sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotid thì enzyme gắn sai một nucleotid). Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt.