3. í nghĩa khoa học và thực tiễn
3.2.2. Kết quả phõn lập vi khuẩn E.coli và C perfringens từ cỏc mẫu
phẩm của lợn mắc tiờu chảy
Trong quỏ trỡnh mổ khỏm xỏc định cỏc tỷ lệ bệnh tớch ở lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi bị chết do tiờu chảy, chỳng tụi đó tiến hành lấy mẫu là một số cơ quan phủ tạng của cỏc lợn này để xột nghiệm, phõn lập vi khuẩn E.coli và C. perfringens. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.7.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.7: Kết quả phõn lập vi khuẩn E. coli và C. perfringens từ cỏc mẫu bệnh phẩm Loại bệnh phẩm Số mẫu bệnh phẩm Loại vi khuẩn phõn lập E. coli C. perfringens Số mẫu dƣơng tớnh Tỷ lệ % Số mẫu dƣơng tớnh Tỷ lệ % Gan 12 12 100,0 3 25,0 Lỏch 12 12 100,0 4 33,3 Ruột 12 12 100,0 9 75,0
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy: khi lợn bị bệnh tiờu chảy thỡ ở gan, lỏch, ruột đều xỏc định được sự cú mặt của vi khuẩn E. coli và C. perfringens. đặc biệt là trong cỏc loại bệnh phẩm (gan, lỏch, ruột) đều thấy cú sự xuất hiện của vi khuẩn
E.coli với tỷ lệ phõn lập là 100%, cũn với vi khuẩn C. perfringens thỡ trong 12
mẫu được kiểm tra, tỷ lệ phõn lập được ở ruột là cao nhất, chiếm tỷ lệ 75,0%, cũn ở gan và lỏch chiếm tỷ lệ thấp hơn, lần lượt là 25% và 33,3%.
Nghiờn cứu của Nguyễn Thị Nội (1985)[28] tiến hành phõn lập E. coli từ cỏc phủ tạng của lợn bị tiờu chảy và đó xỏc định được tỷ lệ của vi khuẩn này chiếm tới 95,4% trong tổng số lợn điều tra.
Tỏc giả Trần Thị Hạnh và cs (2002)[15] khi phõn lập vi khuẩn E. coli từ phủ tạng lợn con theo mẹ bị tiờu chảy đó cho kết quả như sau: tỷ lệ vi khuẩn E. coli cú mặt ở hạch ruột và ruột non là 100%, mỏu tim 81,8%, gan 72,7%, lỏch 63,6%, thận 72,7%.
Cỏc kết quả trờn đó phần nào chứng tỏ rằng vi khuẩn E. coli và C. perfringens đúng vai trũ quan trọng gõy bệnh tiờu chảy cho lợn từ sơ sinh
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
đến 60 ngày tuổi nuụi tại Hưng Yờn. Điều này cũng đó được nhiều tỏc giả khẳng định, đồng thời cũng phự hợp với cơ chế gõy bệnh của vi khuẩn E. coli và C. perfringens mà chỳng tụi đó trỡnh bày ở phần tổng quan.
3.2.3. Kết quả xỏc định số lƣợng vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong phõn lợn bệnh và lợn bỡnh thƣờng
Nhiều tỏc giả khi nghiờn cứu về hội chứng tiờu chảy ở lợn đó cho rằng: loạn khuẩn đường ruột là nguyờn nhõn gõy ra tiờu chảy ở lợn. Sự biến động về số lượng vi khuẩn cú trong phõn lợn tiờu chảy phản ỏnh hiện tượng loạn khuẩn đường ruột. Để tỡm hiểu vấn đề này, chỳng tụi tiến hành xỏc định số lượng vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong phõn của lợn bị tiờu chảy và lợn bỡnh thường. Kết quả mức độ biến động số lượng vi khuẩn ở lợn trong cỏc giai đoạn sinh trưởng khỏc nhau được thể hiện ở bảng sau:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.8: Mức độ biến động vi khuẩn E. coli và C. perfringens trong phõn lợn khỏe và phõn lợn tiờu chảy
Tuổi lợn (ngày)
Lợn tiờu chảy Lợn bỡnh thƣờng Mức độ biến động VK ở
lợn tiờu chảy so với lợn bỡnh thƣờng (Số lần tăng) Số lƣợng VK (x 106
) TB/g phõn Số lƣợng VK (x 106
) TB/g phõn
Số mẫu
kiểm tra E. coli C. perfringens
Số mẫu
kiểm tra E. coli C. perfringens E. coli C.
perfringens 1-21 5 161,2 39,7 4 6,7 2,1 24,1 18,9 22-45 7 149,5 42,5 5 8,2 2,3 18,2 18,5 46-60 5 138,7 38,7 5 5,9 2,5 23,5 15,5 Tớnh chung 5,7 149,8 40,3 4,7 6,9 2,3 21,9 17,5 - 66 -
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy: cú thể thấy ngay số lượng vi khuẩn E. coli
cú trong chất chứa đường ruột của lợn bị tiờu chảy cao hơn rất nhiều (~ 22 lần) so với lợn khoẻ mạnh, cũn số lượng vi khuẩn C. perfringens ở lợn tiờu
chảy cao hơn gấp ~18 lần so với lợn bỡnh thường. Cụ thể như sau:
- Số lượng vi khuẩn E. coli trung bỡnh đếm được trong 1 g phõn của lợn bỡnh thường ở 1 - 21 ngày tuổi là 6,7 x 106 vi khuẩn; 22 - 45 ngày tuổi là 8,2 x 106 vi khuẩn; ở 46 - 60 ngày tuổi là 5,9 x 106. Số lượng này đó tăng lờn rất nhiều ở lợn tiờu chảy, tương ứng với cỏc số lượng là 161,2 x 106
(tăng 24,1 lần); 149,5 x 106
(tăng 18,2 lần) và 138,7 x 106 (tăng 23,5 lần) ở lợn cỏc giai đoạn 1 -21; 22 - 45; và 46 - 60 ngày tuổi).
- Vi khuẩn C. perfingens trung bỡnh đếm được trong 1 g phõn của lợn bỡnh thường ở 1 - 21 ngày tuổi là 2,1x 106 vi khuẩn; 22 - 45 ngày tuổi là 2,3 x 106 vi khuẩn; ở 46 - 60 ngày tuổi là 2,5 x 106. Số lượng này cũng đó tăng lờn rất nhiều ở lợn tiờu chảy (1-21; 22-45; 46-60 ngày tuổi) với cỏc con số tương ứng là 33,7 x 106
(tăng 18,9 lần); 42,5 x 106 (tăng 18,5 lần); 38,7 x 106 (tăng 15,5 lần) vi khuẩn trong 1 g phõn.
Kết quả xỏc định số lượng vi khuẩn cũng phự hợp với kết quả phõn lập vi khuẩn như đó trỡnh bày ở bảng 3. 6 và bảng 3.7. Cả 2 loại vi khuẩn đều phõn lập được từ cỏc mẫu là phủ tạng của lợn bệnh và từ cỏc mẫu phõn với tỷ lệ cao.
Kết quả của nghiờn cứu này là cũng phự hợp với nghiờn cứu của một số tỏc giả khỏc, đú là sự tăng lờn về số lượng của vi khuẩn trong đường ruột của lợn mắc bệnh tiờu chảy. Tỏc giả Trương Quang (2005) [42], khi kiểm tra số lượng vi khuẩn E. coli/1g phõn từ 314 mẫu phõn của lợn khụng bị tiờu chảy và 312 mẫu của lợn bị tiờu chảy, cho kết quả là số lượng vi khuẩn ở lợn 1 - 21
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
ngày tuổi cao gấp 2,46 - 2,73 lần và ở lợn 22 - 60 ngày tuổi là 1,88 - 2,10 lần so với lợn khụng bị tiờu chảy.
Theo Bergelan và cs (1986)[63] thỡ trong chất chứa của ruột ở lợn khoẻ mạnh khụng cú biểu hiện tiờu chảy thỡ chỉ chứa một lượng vi khuẩn yếm khớ
C. perfringens là 105 vi khuẩn/g, cũn khi số lượng vi khuẩn lờn tới 106/g được coi là ngưỡng bệnh lý và cần phải cú biện phỏp can thiệp kịp thời.
Cỏc tỏc giả Hồ Soỏi và Đinh Thị Bớch Lõn (2005) [44] cũng phõn lập
E. coli ở lợn con từ 1 - 60 ngày tuổi nhưng chia thành 2 giai đoạn phỏt triển
khỏc nhau của lợn, cho kết quả là số lượng vi khuẩn E. coli phõn lập được từ lợn bị tiờu chảy ở 1- 45 ngày tuổi là 132,79 106/g phõn và ở lợn 40 - 60 ngày tuổi là 124,08 106/g phõn, gấp 2,37 lần và 1,39 lần, so với lợn khụng bị tiờu chảy.
Nghiờn cứu của Trần Thị Hạnh và cs (2000)[14], khi lợn bị viờm ruột tiờu chảy, số lượng vi khuẩn C. perfingens cú sự tăng cao hơn so với bỡnh
thường tới hàng triệu vi khuẩn trong 1 g phõn.
Từ cỏc dẫn liệu khoa học trờn, kết hợp với kết quả của nghiờn cứu này, cho thấy cú sự khỏc nhau về số lượng vi khuẩn E. coli trong 1 g chất chứa giữa cỏc lứa tuổi của lợn. Điều này cú thể được giải thớch dựa trờn cơ sở khỏc nhau về đặc điểm sinh lý trong từng giai đoạn sinh trưởng của lợn, sự dần hoàn thiện chức năng bộ mỏy tiờu hoỏ cũng như khu hệ sinh vật trong đường ruột và thời gian tiếp xỳc với điều kiện ngoại cảnh. Ngoài ra, thành phần và số lượng vi khuẩn của đường ruột phụ thuộc vào nhiều yếu tố khỏc nữa như: thể trạng của lợn, tập quỏn chăn nuụi, khẩu phần dinh dưỡng, chất lượng thức ăn...
Lợn khoẻ mạnh bỡnh thường, số lượng vi khuẩn đường ruột luụn luụn ở thế cõn bằng động, nhưng khi lợn bị stress làm giảm sức đề khỏng cơ thể, một
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
số loại vi khuẩn sẽ cú cơ hội phỏt triển tăng nhanh về số lượng làm mất tớnh cõn bằng động và gõy bệnh tiờu chảy. Trong thớ nghiệm này, cú thể thấy vi khuẩn E. coli đó cú sự tăng đột biến rất lớn về số lượng khi lợn mắc tiờu chảy, và cú thể là trong quỏ trỡnh phỏt triển, vi khuẩn E. coli đó sản sinh ra chất
khỏng khuẩn Colicin V ức chế sự phỏt triển của cỏc loại vi khuẩn đường ruột khỏc, để chiếm vị trớ độc tụn trong hệ vi khuẩn đường ruột. Vấn đề này cũng đó phần nào lý giải cho hiện tượng vỡ sao tỷ lệ phõn lập được cỏc loại vi khuẩn khỏc như: Salmonella, Clostridium và một số vi khuẩn đường ruột khỏc là rất thấp trong cỏc mẫu được kiểm tra.
3.2.4. Kết quả giỏm định đặc tớnh sinh hoỏ của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập đƣợc
Mỗi loại vi khuẩn cú một số đặc tớnh sinh học riờng biệt như: tớnh chất mọc của vi khuẩn trờn cỏc mụi trường nuụi cấy thụng thường và mụi trường đặc hiệu, chuyển hoỏ cỏc loại đường và sinh sản cỏc hợp chất sinh học trung gian trong mụi trường nuụi cấy. Do đú sau khi đó tiến hành giỏm định cỏc đặc điểm về hỡnh thỏi và nuụi cấy trờn mụi trường nước thịt, thạch thường, macconkey, thạch mỏu, Endo của cỏc chủng vi khuẩn phõn lập nhằm phõn loại và xỏc định đỳng loài, trờn cơ sở đú cú những nghiờn cứu tiếp theo.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 39: Kết quả giỏm định đặc tớnh sinh húa của cỏc chủng vi khuẩn E. coli và C. perfringens phõn lập đƣợc TT Loại phản ứng sinh húa Kết quả E. coli (n=30) Cl. perfringens (n=15) Số chủng dƣơng tớnh/Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ % Số chủng dƣơng tớnh/Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ % 1 Indol 30/30 100.0 0/15 0 2 MR 30/30 100.0 - - 3 VP 0/30 0 - - 4 Citrat 0/30 0 - - 5 Inositol 0/30 0 - - 6 Lactose 30/30 100.0 12/15 80.0 7 Maltose 30/30 100.0 13/15 86.7 8 Mannitol 30/30 100.0 - - 9 Mannose 30/30 100.0 - - 10 Sorbitol 30/30 100.0 - - 11 Xylose 30/30 100.0 - - 12 Glucose 30/30 100.0 14/15 93.3 13 Sucrose 22/30 73.3 15/15 100.0
Ghi chỳ: - : Khụng kiểm tra Kết quả của bảng 3.9 cho thấy:
+ Tất cả cỏc chủng E. coli phõn lập được (100%) đều cú khả năng gõy dung huyết trờn mụi trường thạch cú bổ sung 5% mỏu cừu. 100% cỏc chủng E.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
ứng VP và Citrat thỡ đều cho kết quả õm tớnh. Tỷ lệ cỏc chủng lờn men đường Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Sorbitol, Xylose là 100%. Riờng với đường sucrose tỷ lệ lờn men 73,3%, cũn đường inositol thỡ cho kết quả õm tớnh. + Tất cả cỏc chủng C. perfringens được kiểm tra đều cú phản ứng Indol õm tớnh. Tỷ lệ cỏc chủng vi khuẩn lờn men đường sucrose là 100%, cũn với cỏc loại đường Lactose, Maltose, Glucose thỡ tỷ lệ lờn men lần lượt là 80,0%, 86,7% và 93,3%.
So sỏnh kết quả giỏm định đặc tớnh sinh hoỏ của 30 chủng vi khuẩn E. coli và 15 chủng C. perfringens phõn lập được với bảng sinh hoỏ chuẩn của
cỏc loại vi khuẩn này thỡ thấy cỏc chủng vi khuẩn phõn lập được từ lợn tiờu chảy tại Hưng Yờn đều cú cỏc đặc điểm chung, rất điển hỡnh của vi khuẩn E.
coli hoặc C. perfringens như đó được cỏc tài liệu trong và ngoài nước mụ tả.
3.2.5. Kết quả xỏc định serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng E. coli
phõn lập đƣợc
Serotyp O của 30 chủng vi khuẩn E. coli đó được xỏc định bằng phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10: Kết quả xỏc định serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng vi khuẩn E. coli phõn lập đƣợc từ lợn bệnh TT Serotyp O Kết quả (n=30) Số chủng dƣơng tớnh Tỷ lệ (%) 1 O8 3 10,0 2 O101 4 13,3 3 O138 3 10,0 4 O139 4 13,3 5 O141 4 13,3 6 O149 12 40,0 Tổng số 30 100
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy tất cả 30 chủng vi khuẩn E. coli được kiểm tra đều cho phản ứng dương tớnh với 1 trong 6 serotyp khỏng huyết thanh O. Trong đú, số chủng thuộc serotyp O149 là 12 chủng, chiếm tỷ lệ cao nhất là 40,0%; số chủng thuộc cỏc serotyp O141, O101 và O139 là bằng nhau, 4 chủng, chiếm tỷ lệ 13,3%. Serotyp O8 và O138 cú tỷ lệ thấp nhất, chỉ chiếm 10,0%.
Theo tỏc giả Nguyễn Thị Nội (1985)[28] cỏc chủng E. coli phõn lập được từ lợn con chủ yếu thuộc cỏc serotyp O149: K88; O147: K88; O141: K88. Theo Lờ Văn Tạo và cs (1993)[46], từ 50 chủng E. coli phõn lập từ lợn con theo mẹ thỡ 15 chủng mang khỏng nguyờn bỏm dớnh K88 chủ yếu thuộc cỏc serotyp: O141, O1, O149, O86, O111, O55, O26.
Theo Bertschinger và cs (1992)[66] nghiờn cứu ở Thụy Điển thỡ thấy đa số cỏc chủng E. coli phõn lập được thuộc serotyp O139 (25/32), ngoài ra cũn cú cỏc serotyp O141, O149, O138.
Theo Fairbrother, J, M (1992) [74], cỏc seroyp O138, O139, O141 và O149 thuộc nhúm vi khuẩn ETEC và VTEC là cỏc nhúm thường hay gặp nhất gõy tiờu chảy cho lợn con sau cai sữa.
Tỏc giả Vũ Khắc Hựng và cs (2004) [20] khi xỏc định serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng E. coli phõn lập từ lợn con bị tiờu chảy ở Cộng hoà Slovakia lại thấy rằng: Serotyp O149 chiếm tỷ lệ cao nhất (77%) trong tổng số 220 chủng vi khuẩn được kiểm tra, serotyp O141 cú tỷ lệ thấp hơn 4,5%. Cỏc serotyp O2, O15, O101 và O157 cú cựng tỷ lệ là 1,8%, cũn lại cỏc serotyp O8, O54, O84, O147 chiếm cỏc tỷ lệ tương ứng là 6,3%; 2,2%; 2,7%; 2,2%.
Cũng xỏc định serotyp khỏng nguyờn O của cỏc chủng E. coli phõn lập được ở lợn sau cai sữa ở những địa điểm lấy mẫu khỏc là khu vực đồng bằng sụng Cửu Long, Nguyễn Khả Ngự (2000) [32] cho biết, trong số 11 serotyp
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
được xỏc định, O26 chiếm tỷ lệ cao nhất 27,8%, tiếp theo là O139 chiếm tỷ lệ 13,9%, cỏc serotyp O127, O111, O124, O125, O126, O86, O149 đều chiếm tỷ lệ 8,3%, cũn serotyp O55, O128 chỉ chiếm tỷ lệ 2,8%. Kết quả của tỏc giả Nguyễn Khả Ngự ớt nhiều cú sự sai khỏc với cỏc kết quả của nghiờn cứu này, vỡ cỏc mẫu được điều tra trong nghiờn cứu của Nguyễn Khả Ngự cú nguồn gốc là lợn mắc bệnh phự đầu, cũn trong nghiờn cứu này là mẫu được lấy từ cỏc lợn sau cai sữa bị mắc bệnh tiờu chảy.
Ở tỉnh Tiền Giang, cỏc tỏc giả Bựi Trung Trực và cs (2004) [60] lại thấy cỏc serotyp O8, O64, O142, O138 và O139 là phổ biến, trong đú O139 chiếm tỷ lệ cao nhất. Tỏc giả cũng đó suy luận là đàn lợn của tỉnh Tiền Giang cú nguy cơ mắc bệnh phự đầu.
Kết quả của chỳng tụi cú sự khỏc biệt so với cỏc nghiờn cứu trờn, nhưng hầu hết cỏc nghiờn cứu đều chỉ ra rằng serotyp khỏng nguyờn O149 chiếm tỷ lệ cao và là một serotyp chớnh gõy bệnh cho lợn.
3.2.6. Kết quả xỏc định cỏc yếu tố gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E. coli
Để gõy bệnh cho lợn vi khuẩn E. coli thuộc nhúm ETEC phải bỏm dớnh được vào tế bào nhung mao ruột non của lợn, từ đú xõm nhập vào tế bào biểu mụ, ở đõy vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột. vỡ vậy yếu tố bỏm dớnh cú vai trũ quan trọng đối với quỏ trỡnh gõy bệnh của vi khuẩn E. coli. Fairbrother.
J.M (1992)[74] coi yếu tố bỏm dớnh là yếu tố quan trọng chỉ sau enterotoxin trong việc xỏc định vai trũ gõy bệnh của cỏc chủng vi khuẩn E. coli .
Cỏc yếu tố bỏm dớnh F4, F5, F6, F18, F41, độc tố chịu nhiệt STa, STb, độc tố