2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới
Triệu chứng vàng lá xuất hiện trên mía ở Hamakua thuộc bờ biển của đảo Hawaii năm 1989. Chúng đƣợc thấy ở trên những cánh đồng giống H65-7052 và nĩ khơng giống nhƣ triệu chứng của sự thiếu dinh dƣỡng. Sau đĩ triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở tất cả các cánh đồng ở Hawaii (Schenck, 1990; trích bởi Schenck, 2001).
Bệnh vàng gân lá gây ra bởi ScYLV là một bệnh quan trọng tiềm tàng đƣợc nhập vào Louisiana gần đây. Một cuộc khảo sát rộng để xác định sự phân bố của ScYLV cho thấy virus này đã hiện diện trên tất cả các vùng trồng mía cơng nghiệp ở Louisiana (McAllister, 2006).
Ở Ecuador cĩ 2 bệnh virus chính trên mía là bệnh vàng lá do SCYLV và bệnh khảm do Sugarcane mosaic virus (SCMV). Phạm vi tác động của bệnh vàng gân lá trên những cánh đồng thƣơng mại cao và bệnh này đã lan rộng trong cả nƣớc (Garcés và cộng sự, 2006).
Ở Mauritius YLS đã đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1994 trên giống CP 72 1210. Tiếp sau đĩ triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở một vài giống khác và sự hiện diện của ScYLV đã đƣợc xác định vào năm 1990 (S. M. Aljanabi và cộng sự, 2001).
ScYLV đƣợc phát hiện đầu tiên ở Nam Phi năm 1997. ScYLV xuất hiện và lan rộng nhanh chĩng trên những cánh đồng chọn lọc và lai tạo giống ở Pongola từ những cây bị nhiễm sang những cây mẫn cảm chƣa nhiễm khi chúng đƣợc trồng gần nhau.
Ở Colombia ScYLV đã đƣợc phát hiện năm 1998. Nĩ đã nhiễm vào một vài giống thƣơng mại, đặc biệt là giống CC 84-75 đƣợc trồng phổ biến thứ hai trên các vùng trồng mía của nền cơng nghiệp mía Colombia. Vì sự mẫn cảm của hầu hết các giống lai và tính quan trọng của giống CC 84-75, triển vọng tạo ra những cây chuyển gene kháng lại ScYLV đã đƣợc nghiên cứu (Rangel và cộng sự, 2005).
Tƣơng tự triệu chứng héo vàng cũng đƣợc nhận thấy ở trung tâm và đơng châu Phi ở những năm 1960.
Ở Brazil đã xuất hiện trên giống SP 71-6163 năm 1990 với diện tích 750000 ha. Hạt virus và kháng nguyên của ScYLV đã đƣợc xác định bởi EM, ISEM và DAS-ELISA trên các mẫu mơ lá mía cĩ triệu chứng YLS từ Australia, Brazil, Colombia, Mỹ, Guadeloupe, Malawi, Mauritius, Reunion Island, và Nam Phi. Kết quả
dƣơng tính với ScYLV ở tất cả các mẫu trên (Scagliusi và Lockhart, 2000). Chứng tỏ đã xuất hiện ScYLV ở tất cả các nƣớc trên.
Tồn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion) đã đƣợc giải trình tự. Bốn kiểu gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng lồi với trình tự bộ gene của 6 vùng này. Cặp primer đặc biệt đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV bằng RT-PCR (Abu Ahmad và cộng sự, 2006).
Ở Hawaii một vài kỹ thuật miễn dịch đã thành cơng trong việc chẩn đốn sự nhiễm của ScYLV dựa trên những kháng thể đặc hiệu. Mặc dù vậy quá trình tinh sạch virus từ cây bị nhiễm gặp phải khĩ khăn do virus bị hạn chế trong mạch libe và hiện diện với nồng độ thấp. Một lƣợng nhỏ protein của mía cịn lại gây trở ngại cho độ đặc hiệu của kháng thể. Vì thế một kháng thể cĩ hoạt tính và độ đặc hiệu cao đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc sử dụng trong chẩn đốn mà khơng bị trở ngại bởi protein của mía và các luteovirus hay polerovirus (Wang, Schenck và Albert, 2006).
ScYLV là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley (Colombia). Trong suốt năm 2004, tỉ lệ nhiễm bệnh ScYLS trên các cánh đồng thƣơng mại là 12,2%. Sự hiện diện của các nịi ScYLS đã đƣợc xác định bằng kỹ thuật RT-PCR với primer o-FM359/323. Kết quả thu đƣợc là một band 1200bp đã đƣợc khuếch đại. Khi cắt sản phẩm này với enzyme cắt Sau 3AI thì thu đƣợc 3 band. Band 100bp và 200bp đƣợc phát hiện thì phù hợp với nịi ở Brazil và band 300bp là đặc thù của nịi Texas- Florida. Những mẫu xuất hiện đồng thời 3 band thì cĩ thể là một nịi mới (Angel và cộng sự, 2006).
Comstock và cộng sự (2005) đã sử dụng marker phân tử để xác định tính kháng ScYLV trên mía.
2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam
Hà Đình Tuấn (2004) đã dựa vào triệu chứng và Brix kế để nghiên cứu về bệnh vàng gân lá. Kết quả cho thấy hầu hết các giống đƣợc nghiên cứu đều nhiễm bệnh vàng gân lá. Đây là nghiên cứu về bệnh vàng gân lá đầu tiên tại Việt Nam.
2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR
2.4.1 PCR
Kĩ thuật PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985. Đây là một cơng cụ khá mới trong sinh học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kì quan trọng và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng nhƣ nghiên cứu. Thực chất nĩ là một phƣơng pháp tạo dịng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).
Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuơn đều cần sự hiện diện của những mồi.
Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuơn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đĩ nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đĩ cĩ nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải cĩ thơng tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế
ADN đích 1 Biến tính (94o) 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 Kéo dài (72o) 1 2 3 4 n
các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuơi (sense primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisense primer hay reverse primer). Từ “xuơi” và “ngƣợc” phải hiểu là “xuơi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen.
PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: - Biến tính phân tử DNA (Denature).
- Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuơn (Annealing). - Tổng hợp mạch mới (Extension).
Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần.
Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (chẳng hạn nhƣ Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp.
2.4.2 RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR) thì tƣơng tự nhƣ kỹ thuật PCR, nĩ cho phép khuếch đại một lƣợng nhỏ RNA. Kỹ thuật này thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện RNA của virus.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là trƣớc tiên RNA sẽ đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc (reverse trascriptase) (hình 2.13). Mồi sử dụng cho phƣơng pháp này cĩ thể là mồi “ngƣợc” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng cĩ thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuơi poly A của các mRNA) mà cũng cĩ thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự ngắn trên RNA. Sau đĩ, cDNA sẽ đƣợc khuếch đại nhờ hoạt động của Taq
polymerase. Ngồi ra, ngƣời ta cũng cĩ thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục khuếch đại thơng qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên.
Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp khơng thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thơng thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).
Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR
Khuơn RNA
Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA (primer cĩ thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay mồi chuyên biệt cho gene).
cDNA đƣợc tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ enzyme reverse trascriptase.
Sợi cDNA đƣợc tạo thành.
Khuơn RNA đƣợc loại bỏ nhờ Rnase H. cDNA đƣợc sử dụng để thực hiện PCR.
Sự gắn của primer với cDNA.
Sợi bổ sung của cDNA đƣợc tổng hợp nhờ taq polymerase.
cDNA sợi đơi đƣợc hình thành.
Ba bƣớc biến tính, bắt cặp, kéo dài đƣợc lặp lại nhiều lần.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006. Địa điểm lấy mẫu
Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bến Cát, Bình Dƣơng.
Xã Tân An, thị xã Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng.
Xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai.
Xã Mỹ Thạnh Tây, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An.
Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Hĩa Sinh và Trung tâm Cơng nghệ và Quản lý Tài nguyên và Mơi trƣờng Trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu
Chúng tơi tiến hành lấy mẫu lá ở vị trí +2 (Hình 3.1). Mỗi mẫu lấy ở năm bụi khác nhau.
Hình 3.1. Vị trí lá trên cây.
Đối với tập đồn giống mía gốc và giống mía mới nhập từ Thái Lan chúng tơi tiền hành lấy mỗi giống một mẫu. Đối với mía đƣợc nhân giống để sản xuất và mía nguyên liệu, số lƣợng mẫu đƣợc lấy tùy vào diện tích canh tác.
Mẫu sau khi lấy đƣợc mã hĩa, ghi nhãn và bảo quản cẩn thận (-200
C) trong suốt quá trình phân tích.
3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.3.1 Máy mĩc, thiết bị 3.3.1 Máy mĩc, thiết bị
- Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh). - Máy li tâm (Sigma, Hettich).
- Tủ mát (nhiệt độ 2 - 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hĩa chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo).
- Tủ định ơn (cài đặt ở 37oC) (Memmert). - Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert). - Máy vortex (IKA Works).
- Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Eppendorf). - Lị viba (Electrolux).
- Cân phân tích.
- Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad). - Máy đọc gel (Biorad).
- Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus). - Kính hiển vi quang học (Olympus). - Máy chụp hình 4.0 (Olympus). - Màn hình Sony.
3.3.2 Dụng cụ
- Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu. - Kéo. - Eppendorf 1,5 ml. - Eppendorf 0,2 ml. - Hộp đựng eppendorf. - Micropipette P1000. - Micropipette P100. - Đầu tip 1000 μl. - Đầu tip 100 μl. - Ống đong 20, 50, 100ml. - Khay đổ gel điện di.
- Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel). - Lame và lamelle.
3.4 Hĩa chất
3.4.1 Hĩa chất sử dụng trong RT- PCR Hĩa chất dùng trong tách chiết RNA Hĩa chất dùng trong tách chiết RNA
Sử dụng kit ly trích AurumTM
Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp gồm:
- Dung dịch ly giải.
- Dung dịch rửa nhẹ (5X). - Dung dịch rửa mạnh.
- DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trƣớc khi sử dụng). - Dung dịch pha lỗng DNase.
- Dung dịch pha lỗng RNA.
- β- mercaptoethanol 14,2 M (catalog #161-0710) (*). - Polyvinylpyrolidone- 40 (PVP), 2 % (*). - Ethanol 100 % và 70 % (*). - Tris-base (pH 7,5, 10 mM) (*). - Nitơ lỏng (*). - NaOH 0,1M (*). - EDTA 1mM (*).
- DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (*).
(
*): Hĩa chất đƣợc cung cấp riêng, khơng kèm theo kit.
Hĩa chất sử dụng tạo cDNA và PCR
- Nƣớc khơng chứa nuclease. - iTaq buffer 10X (Biorad).
- iTaq DNA polymerase (Biorad). - MgCl2 (50 mM) (Biorad).
- dNTP mix (10 mM) (BioRad).
- Primer: Hai primer YLS 462 và YLS 111 (trình tự primer đƣợc cung cấp bởi TS. M. Irey).
YLS111: 5' - TCT CAC TTT CAC GGT TGA CG-3’ YLS462: 5' - GTC TCC ATT CCC TTT GTA CAG C-3’
3.4.2 Hĩa chất sử dụng trong điện di
- TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8). - Blue/Orange Loading dye 6X (Promega).
- Ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích).
- Ladder 100 bp (kích thƣớc 1000 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 1,5 %.
3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang
Gân lá và bản lá đƣợc cắt mỏng bằng dao lam mới. Sau đĩ, thiết vật đƣợc đặt trong một giọt nƣớc cất hai lần đã khử trùng trên lame. Đặt lamelle lên và quan sát các bĩ mạch libe ở các độ phĩng đại 40X, 100X, 200X và 400X với ánh sáng đơn sắc màu xanh (blue) bƣớc sĩng 510nm.
Những bĩ mạch libe bị nhiễm virus sẽ phát huỳnh quang màu vàng xanh bởi ánh sáng kích thích 510nm. Những bĩ mạch bình thƣờng sẽ khơng phát huỳnh quang.
3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR đƣợc thực hiện là hai bƣớc (two steps): gồm giai đoạn tổng hợp cDNA và giai đoạn khuếch đại cDNA. Virus đƣợc phát hiện dựa trên trình tự đoạn gene cĩ kích thƣớc 352 bpmãhĩa cho protein vỏ của virus ScYLV.
Qui trình thực hiện gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn ly trích RNA đƣợc thực hiện bằng kit ly trích RNA.
Giai đoạn tổng hợp cDNA đƣợc thực hiện theo kit tổng hợp cDNA .
Phản ứng RT-PCR đƣợc thực hiện dựa trên protocol của TS. Michael Ireycung cấp.
3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA
Quy trình gồm cĩ 15 bƣớc nhƣ sau:
1. Cắt mẫu thành những miếng nhỏ (< 5 mm), nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý khơng để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền.
2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml cĩ nắp đậy (cĩ sẵn trong kit). Hịa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) (14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu). Tạo hỗn hợp dung dịch ly giải nhƣ sau: Hút 500 l -mercaptoethanol cho vào 50 ml dung dịch ly giải, hút 700 l dung dịch ly giải đã cĩ - mercaptoethanol cho vào eppendorf mới, thêm 14 l PVP vào.
3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube chứa mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần.
4. Ly tâm với tốc độ 13000 vịng trong 3 phút ở 4oC. Sau đĩ hút dịch nổi sang tube 2 ml (cĩ trong kit).
5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến khi dịch khơng cịn phân lớp.
6. Cho dịch hịa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70oC (chuẩn bị cho bƣớc 15). Cho RNA binding column vào tube 2 ml khơng cĩ nắp đậy.
7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000 vịng trong 1 phút ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần cho đến khi hết mẫu thì thơi).
8. Cho 80 ml ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency).
9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vịng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới.
10.Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều.
11.Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha lỗng DNase (DNase delution solution) cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml.
Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phịng.
Ly tâm 12000 vịng trong 30 giây ở 4o
C. 12.Loại phần dịch bên dƣới.
13.Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA binding column.
Ly tâm 12000 vịng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới.
14.Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding column.
Ly tâm 12000 vịng trong 30 giây ở 4o
C. Loại phần dịch bên dƣới.
Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vịng ở 4oC để loại hồn tồn dịch rửa. 15.Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (cĩ trong kit) cĩ nắp đậy.
Cho 80 µl dịch hịa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70oC vào RNA binding column, giữ ở nhiệt độ phịng trong 60 giây.
RNA đem ủ ở 4oC để dùng sau.
3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR theo protocol của TS. M. Irey 3.6.2.1 Bƣớc chẩn bị mẫu 3.6.2.1 Bƣớc chẩn bị mẫu
YLS 462 primer (60 uM stock) 0,25 μl
H2O 0,25 μl
Mẫu 1,00 μl
Ủ trong 5 phút sau đĩ làm lạnh nhanh trong đá. Ly tâm nhẹ.
3.6.2.2 Bƣớc RT MgCl2 (25 mM) 2,0 μl PCR buffer10X 1,0 μl dGTP (10 mM) 1,0 μl dCTP (10 mM) 1,0 μl dATP (10 mM) 1,0 μl dTTP (10 mM) 1,0 μl H2O 0,5 μl
Rnase inhibitor (20 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer)
MulV Reverse transcriptase (50 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer) Tổng thể tích 8,5 μl và thêm vào 1,5 μl hỗn hợp mẫu và primer
Chu trình nhiệt của phản ứng RT: 15 phút ở 420 C, 5 phút ở 990 C - 1 chu kỳ.
3.6.2.3 Bƣớc PCR
MgCl2 (25 mM) 4,00 μl
10X PCR buffer 4,00 μl
H2O 31,50 μl
Amplitaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Perkin Elmer)
YLS 111 primer (60 uM stock) 0,25 μl