3.3.2.1. Nguyên lí phản ứng Real time PCR (RT – PCR).
- Phản ứng Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuyếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT – PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy BIO – RAD, máy có bộ phận (Camera) có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT
(Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → DNA gọi là Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT – PCR
- Nguyên lí hoạt động của Probe.
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên Primer và Probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real time RT – PCR là Taqman Probe.
Hình 3.1. Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.
3.3.2.2. Các bước tiến hành phản ứng Real time RT – PCR.
Các bước tiến hành phản ứng được thực hiện theo quy trình chung “hướng dẫn của cục thú y” trong phòng thí nghiệm . Bao gồm các bước:
1) Chiết tách RNA. 2) Chuẩn bị Master mix.
3) Template mẫu.
4) Chạy PCR trên máy Bio – Rad hoặc Smart Cycle. 5) Đọc kết quả
3.3.2.2.1. Quy trình chiết tách RNA
Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch đệm RLT bổ sung 2-mecraptoethanol tỷ lệ 1:100 và RPE bổ sung 4 lần thể tích ethanol. Mẫu sau khi được xử lí sẽ tiến hành chiết tách RNA theo các bước sau [9]:
1) Cho 600µl đệm RLT đã được bổ sung 2-mecraptoethanol vào ống eependorf 1,5ml.
2) Chuyển 200µl mẫu vào ống eependorf. Vortex trong 15s sau đó spin ở 5000vòng/phút trong 5s cho lắng xuống. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. 3) Cho thêm 480µl ethanol 96 – 100% và 120µl nước Nuclease free
water. Vortex 10s rồi ly tâm 9000 vòng/phút trong 5 phút.
4) Lắp khóa van vào hệ thống và gắn cột lọc vào van. Bật máy hút chân không, điều chỉnh khóa van để P = 600.
5) Cho hết toàn bộ mẫu trên vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. 6) Cho 700µl RW1 vào cột lọc, rút hết dung dịch rửa trong cột lọc. 7) Cho 500µl RPE vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. 8) Lặp lại bước 7.
9) Lấy cột lọc ra cho vào ống lọc, li tâm 1400 vòng/phút trong 3 phút 10)Lấy cột lọc đặt vào ống eppendorf, cho vào cột lọc 50µl đệm DW.
Sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 1100 vòng/phút trong 3 phút.
Sơ đồ chiết tách RNA 600µl đệm RLT 200µl mẫu. Vortex 15s, spin 5000vòng/phút trong 5 phút 480 µl ethanol 96÷100% + 120µl
nước free RNase. Vortex 15s ly tâm 9000vòng/phút trong 5 phút Gắn cột lọc và điều chỉnh hệ thống máy hút chân không.
700µl RW1. Rút hết dung dịch trong cột lọc 700µl RPE. Rút hết dung dịch trong cột lọc
Cho cột lọc vào ống lọc. Ly tâm 1400vòng/phút trong 3 phút
Lấy cột lọc cho vào ống eppendorf
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ly tâm 1100vòng/phút trong 3 phút. Thu lấy
3.3.2.2.2.Master mix
Hiện nay Cơ quan thú y vùng III đang sử dụng bộ kít trong phản ứng Realtime RT – PCR là Quiagen one step.
Master mix là bước nhằm trộn lẫn các chất phản ứng cũng như các chất đệm, chất xúc tác cho quá trình sao chép DNA khi có sự tương đồng giữa primer và bộ gen đã chiết tách. Quá trình Master mix được tiến hành trong buồng vô trùng và thực hiện như sau:
Chuẩn bị ống Eppendorf , vortex rồi spin các ống nguyên liệu rồi lần lượt cho các chất vào ống eppendorf như sau:
Reagent Lượng (µl) DW 10.5 5x Reaction Mix 5 MgCl2 25mM 1.2 d NTP 0.8 P.P.P 1.5 Enzyme mix 1 Tổng 20
Sau khi cho các chất trên vào ống Eppendorf ta tiến hành Vortex và spin trong thời gian 10 – 15giây.
3.3.2.2.3. Template mẫu
Template là quá trình chuẩn bị các tube mẫu trước khi chạy trên máy RT – PCR. Trước khi template mẫu, ta chuẩn bị số tube 0,2ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành theo các bước sau:
- Cho 20µl hỗn hợp Master mix vào các tube 0,2ml.
- Cho 50µl nước Free RNase vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng âm (Negative).
- Cho 50µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp Master mix của các tube mẫu.
- Cho 50µl mẫu đối chứng (+) vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng dương (Postive).
3.3.2.2.4. Chạy trên máy RT – PCR
Trước khi cài đặt, vận hành máy ta đặt các tube vào well (giếng) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích các biểu tượng Bio – rad hoặc smart cycler tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu và cài đặt màu cho probe, chu trình nhiệt... Sau khi khai báo xong thì ta bắt đầu chạy máy.
Bộ kit One-step RT-PCR của hãng Qiagen thực hiện phản ứng RT-PCR chạy trên chu trình nhiệt như sau:
RT(bước phiên mã ngược) PCR
500C-30phút 95C-15phút
40chu kỳ x
(95C-10giây+58C-50giây)
3.3.2.2.5. Đọc kết quả
Theo công văn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2010) về việc hướng dẫn chương trình giám sát cúm gia cầm năm 2010 của dự án VAHIP, đối với mẫu giám sát cúm gia cầm là mẫu swab gộp thì được tiến hành như sau:
o Các mẫu swab gộp sẽ được xét nghiệm để xác định type A (M gene). Nếu dương tính với virus cúm A sẽ tiếp tục xét nghiệm để xác định kháng nguyên H5. Nếu âm tính với H5 thì có thể xác định một số H
khác (nếu được sự đồng ý của Dự án).
o Tất cả các mẫu swab dương tính với kháng nguyên H5 sẽ tiếp tục xét nghiệm tìm kháng nguyên N1; nếu dương tính với kháng nguyên H5 mà âm tính với kháng nguyên N1 thì có thể sẽ xác định N khác (nếu được sự đồng ý của Dự án).
o Tất cả các mẫu swab dương tính với virus cúm gia cầm H5N1 hoặc dương tính với kháng nguyên N sẽ được gửi tới phòng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y trung ương để phân lập virus hoặc gửỉ đi nước ngoài để phân tích gene nhằm xác định sự biến chủng của virus. Kết quả xét nghiệm từng chỉ tiêu căn cứ vào giá trị Ct
- Mẫu dương tính khi giá trị Ct ≤ 35 - Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct > 35 - Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Dựa trên công văn và hướng dẫn chương trình giám sát Cúm gia cầm của dự án VAHIP năm 2010 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Trung tâm thú y vùng III đã tiến hành cho lấy mẫu swab trên 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên - Huế tại các chợ buôn bán gia cầm khác nhau như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tỉnh Thanh Hóa lấy mẫu ở 5 chợ: Chợ Bản, Chợ Tây Thành, Chợ Đông Thành, Chợ Kim Tân, Chợ Lưu Vệ.
Tỉnh Hà Tĩnh lấy mẫu trên 4 chợ: Chợ Nghèn Can Lộc, Chợ Thành phố Hà Tĩnh, Chợ Hội Cẩm Xuyên, Chợ Thị xã Hồng Lĩnh.
Tỉnh Thừa Thiên - Huế lấy mẫu trên 5 chợ: Chợ An Lỗ, Chợ Thủy Phương, Chợ Phú Dương, Chợ Hương Chữ, Chợ Xuân Phú.
Mẫu sau khi lấy được bảo quản và gửi về phòng chẩn đoán trung tâm thú y vùng III để tiến hành chẩn đoán.
Sau khi thu mẫu, tiến hành kiểm tra mẫu thì hầu hết các mẫu đều đạt yêu cầu và chúng tôi tiến hành xét nghiệm theo các bước của phương pháp Real time RT – PCR đã trình bày như trên. Kết quả xét nghiệm được xử lí bằng phần mềm ứng dụng Excel theo công thức:
Số mẫu dương tính
Tỷ lệ nhiễm(%) = x 100 Tổng số mẫu xét nghiệm