Để khảo sât hoạt tính tương đối của enzyme CAS, cho văo ống nghiệm 0,2 mL dịch trích enzyme, rồi thím văo 0,8 mL dung dịch tris buffer (0,1 M, pH 8,5) chứa 25 mM sodium cyanide vă 3 mM L-cysteine. Hổn hợp được đậy kín bằng nắp cao su
H2N CH CO2H + HCN H2N CH CO2H + H2S CH2 SH β-cyanoalanine CN CH2 L-cysteine β-cyanoalanine synthase
mềm, ủ vă lắc đều ở 35°C trong 30 phút. Hoạt tính của enzyme được quan sât bằng phản ứng hiện mău xanh methylene. Sau khi H2S được phóng thích từ L-cysteine, 100 µL N, N-dimethyl-p-phenylene diamine 20 mM trong HCl 7,2 N vă 100 µL FeCl3 30 mM trong 1,2 N HCl được thím văo bằng câch bơm qua nắp ống nghiệm. Mău của xanh methylene xuất hiện do sự hiện diện của H2S được xâc định bằng mây đo quang phổở bước sóng 650 nm, sử dụng Na2S lăm chất chuẩn.
http://www.ebook.edu.vn
CHƯƠNG 7. KHẢO SÂT ACID NUCLEIC
7.1. KHÂI QUÂT
Acid nucleic lă câc polymer của nhiều mononucleotide kết hợp với nhau bằng liín kết phosphodiester.
Acid nucleic gồm hai nhóm lớn: Acid deoxyribonucleic (ADN) vă acid ribonucleic (ARN). ADN có khối lượng phđn tử lớn hơn ARN, gồm hai sợi polynucleotide xoắn ngược chiều nhau nhờ câc liín kết hydro giữa câc base nitơ. ARN có cấu tạo 1 sợi polynucleotide.
Acid nucleic lă câc polyanion, dễ hòa tan trong dung dịch kiềm hoặc muối loêng, dựa văo tính chất năy để chiết tâch chúng ra khỏi câc nguồn nguyín liệu sinh vật. Dưới tâc dụng của câc enzyme nuclease hoặc đun nóng acid nucleic với acid, kiềm ở nhiệt độ cao, acid nucleic bị thủy phđn thănh câc mononucleotide. Mỗi mononucleotide được cấu tạo gồm câc base nitơ, đường pentose vă acid phosphoric.
Base nitơ gồm hai loại: base nitơ purine (Adenine vă Guanine), base nitơ pyrimidine (Cytosine, Thymine vă Uracil). Câc base nitơ lă dẫn xuất của câc hợp chất vòng thơm, có khả năng hấp thụ ânh sâng ở vùng tử ngoại với bước sóng từ 250nm đến 280nm.
Đường pentose gồm hai loại: ribose vă deoxyribose. Câc phản ứng mău đặc trưng của ribose (phản ứng orcinol) vă deoxyribose (phản ứng Feugel hoặc diphenylamin), lă cơ sởđể phât hiện ADN vă ARN.
Trong tế băo acid nucleic thường được kết hợp với protein dưới phức hợp nucleoprotein, nín trước khi ly trích acid nucleic cần phải dùng câc chất tẩy rửa vă câc chất lăm biến tính protein để ADN hoặc ARN dễ dăng phóng thích ra môi trường.