- Tiến hành theo quy trình định lượng rotundin bằng HPLC và cột đã được lựa chọn Kết quả thu được ở bảng 3
4.2.Về khảo sát sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin theo tuổi và theo mùa trong năm.
tuổi và theo mùa trong năm.
- Kết quả định lượng alcaloid toàn phần và rotundin đều thực hiện theo phương pháp chính thống, tin cậy của DĐVN IV, đặc biệt là cách bố trí thí nghiệm, đây là kết quả thu được từ thiết kế có quy mô lớn về số mẫu (30 cá thể), mẫu được đồng nhất để bỏ qua đánh giá sai khác giữa các cá thể, mẫu được thực hiện 6 lần độc lập và cho kết quả có độ lặp lại tốt (RSD ≤ 6,0%).
- Trong quá trình tiến hành định lượng rotundin trong củ bằng HPLC theo phương pháp của được điển thấy DĐVN IV [8] chưa quy định về việc đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống sắc ký.
+ Về cột phân tích: cần bổ sung quy định về số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi. Nếu lựa chọn cột có số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đôi đạt yêu cầu thì khả năng tách của cột đảm bảo, các thành phần alcaloid khác không ảnh hưởng tới kết quả rotundin + Ổn nhiệt của cột: nên được quy định do hệ pha động sử dụng có % tỷ lệ dung môi và có nhiều píc (nhiều thành phần trong mẫu) giúp cho cột phân tích ổn định (thời gian lưu, hệ số kéo đuôi)
- Về hàm lượng rotundin theo năm tuổi và theo mùa trong năm: So sánh kết quả đạt được với quy định của chuyên luận dược liệu Bình vôi của DĐVN IV yêu cầu hàm lượng rotundin không nhỏ hơn 0,4% tính theo dược liệu khô. Như vây giới hạn quy định hàm lượng rotundin trong Bình vôi S. glabra là thấp hơn so với thực tế trồng và thu hoạch đúng loài (củ 1 tuổi hàm lượng rotundun đạt 1,35 %). Do đó việc trồng và lựa chọn đúng loài trong quá trình thu hái dược liệu Bình vôi S. glabra là rất quan trọng đem lại chất lượng dược liệu tốt và hiệu quả kinh tế cao.
Các kết quả hàm lượng rotundin thu được trong đề tài này so với một số tác giả trước đã công bố cùng loài S. glabra là có sự tương đồng khi thực hiện cùng
phương pháp HPLC (2,4 – 3,1 %) vì hàm lượng rotundin tích lũy phụ thuộc vào nhiều yếu tố nơi thu hái, độ tuổi thu hái, mùa thu hái khác nhau
55
- Qua sắc ký đồ thu được trong định lượng rotundin qua các mùa trong năm ở cây 4 tuổi thấy số lượng pic, và tỷ lệ diện tích pic so với rotundin khá ổn định có thể xây dựng dấu vân tay hóa học của dịch chiết toàn phần alcaloid loài S. glabra để ứng dụng trong kiểm tra chất dược liệu
- Hàm lượng alcaloid toàn phần và hàm lượng rotundin có trong củ lấy mẫu theo mùa trong năm ở cây trưởng thành cũng thể hiện rõ sự khác nhau giữa các mùa thu hái. Mùa Hạ có hàm lượng alcaloid toàn phần, rotundin tích lũy là thấp nhất, mùa Thu cao nhất điều này cũng phù hợp với quy luật tự nhiên là khi cây trong giai đoạn sinh sản (từ tháng 4 đến tháng 6) thì lượng hoạt chất tích lũy ở bộ phận sinh dưỡng thường giảm xuống điều này phù hợp với đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây.
- Bên cạnh việc theo dõi sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ cây Bình vôi theo năm tuổi và theo mùa trong năm đề tài có tiến hành theo dõi sự thay đổi khối lượng của của theo năng tuổi, củ cây từ 2 lên 3 tuổi, từ 3 lên 4 tuổi tăng nhanh hơn hẳn cây từ 1-2 tuổi điều này rất quan trọng trong việc theo dõi đánh giá năng suất và hiệu quả kinh tế.
- Ở phạm vi cho phép, đề tài này mới chỉ tiến hành nghiên cứu và xác định được mức độ ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình nhân giống hữu tính loài S. glabra, nếu đặt vấn đề trồng dược liệu Bình vôi S. glabra theo hướng dẫn GACP
[9] của WHO thì kết quả của đề tài này mới chỉ là bước đầu nghiên cứu trong vấn đề tạo cây giống của loài này. Tuy nhiên, đây là cơ sở để phát triển cho các nghiên cứu sau này, chi tiết và cụ thể hơn để từ đó áp dụng trong thực tế sản xuất tạo thương phẩm.
- Việc nghiên cứu theo dõi quá trình tích lũy hoạt chất sinh học trong củ cây S. glabra theo sự sinh trưởng và phát triển của cây (theo năm tuổi), và theo điều kiện
thời tiết, mùa vụ (các mùa trong năm) là điều kiện cần thiết và bắt buộc trong quy định của GACP [9]. Kết quả này đóng góp và việc đánh giá chất lượng của dược liệu củ Bình vôi S. glabra và hiệu quả kinh tế, hiệu quả xã hội.
56
Như vậy đề tài đã tiến hành nghiên cứu về 2 nội dung trong quy định về nghiên cứu GACP cây thuốc: quy trình nhân giống hữu tính tạo cây giống chất lượng và sự thay đổi hàm lượng hoạt chất tích lũy trong củ theo năm tuổi và theo mùa trong năm, đây 2 nội dung quan trọng có thể gọi là yếu tố tạo và kiểm soát chất lượng đầu vào và đầu ra của một quy trình lớn (quy trình trồng cây thuốc Bình vôi S. glabra theo nguyên tắc GACP - WHO). Nhân giống hữu tính được lựa chọn vì đối với loài Bình vôi S. glabra khi tiến hành nhân giống vô tính (cắt hom). Trong luận án Tiến sỹ của Nguyễn Tiến Vững, bảo vệ năm 2000 [30] mới sơ bộ theo dõi khả năng tái sinh bằng hom và hạt trong thời gian 1 năm của loài S. glabra, nhân giống từ hom mới theo dõi đến khi ra mô sẹo chưa hình thành củ. Nhóm nghiên cứu có tiếp tục khảo sát thấy rằng cát hom cho tỷ lệ sống, do cây con trong gia đoạn huấn luyện rất yếu, khó thích nghi và đặc biệt khả năng phát triển củ (thân gốc phình thành củ rất chậm), chất lượng cây giống có vai trò quyết định đến chất lượng cây trồng và chất lượng dược liệu. Nếu cây giống đúng loài, có chất lượng cao, cây sẽ có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt, cùng với hàm lượng rotundin cao, ổn định là yêu cầu cơ bản đối với việc phát triển trồng cây Bình vôi S. glabra ở quy mô lớn. Do đó kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình nhân giống từ hạt và đã có tiêu chuẩn cây giống là một đóng góp mới của đề tài, đây là lần đầu tiên đưa ra quy trình nhân giống và tiêu chuẩn cây giống Bình vôi S. glabra có định hướng làm nguyên liệu chiết xuất rotundin các yếu tố được xác định trong nghiên cứu nhân giống góp phần vào việc tạo cây giống khỏe mạnh, có chất lượng tốt và đồng đều sự thích nghi, phát triển khi đem trồng với quy mô lớn.
57
KẾT LUẬN
1. Đã xác định được mức độ ảnh hưởng của một số yếu tố tới nhân giống hữu tính cây Bình vôi S. glabra và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cây giống loài S. glabra - Thu hái quả chín (khoảng tháng 5 hàng năm), quả chín có màu đỏ tươi tách lấy hạt.
- Hạt nên được đem xử lý và gieo ngay sau khi thu hái, không nên bảo quản lâu, điều kiện bảo quản tốt nhất là 2-8o
C (trong tủ lạnh) trong 3 tháng
- Ngâm vào nước 2 sôi 3 lạnh trong suốt 20 giờ rồi đem gieo vào giá thể 12 tháng cho nẩy mầm.
- Cây con đưa vào bầu có tỷ lệ dinh dưỡng 90,0% đất mùn tơi xốp + 10% phân chuồng đã ủ theo tiêu chuẩn.
- Cây con được thiết kế che bóng 50% so với cây không được che bóng
- Chỉ tiêu cây giống Bình vôi S. glabra sau 5 tháng ra bầu (trước khi đem trồng) + Hình thức cây giống: Cây được trồng trong bầu, khoẻ, cứng cáp, lá xanh, không có lá vàng, không có dấu hiệu nhiễm sâu bệnh
+ Chiều dài của củ: Không ít hơn 5 cm + Chu vi của củ: Không ít hơn 4 cm
+ Số lá trên thân cây: Không quá 3 lá trên thân
2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ Bình vôi S. glabra theo năm tuổi và theo mùa trong năm.
- Hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin tích lũy trong củ theo năm tuổi
+ Hàm lượng alcaloid toàn phần tăng dần ở củ của cây từ 1, 2, 3, 4 năm tuổi lần lượt như sau: 1 tuổi (2,13 %), 2 tuổi ( lần 1: 2,61 %; lần 2: 2,64 %), 3 tuổi (lần 1: 4,16 %; lần 2: 4,13%), 4 tuổi (5,76 %). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Hàm lượng rotundin tăng dần ở củ của cây từ 1, 2, 3, 4 năm tuổi lần lượt như sau: 1 tuổi (1,35%), 2 tuổi (lần 1: 1,79%; lần 2: 1,78%), 3 tuổi (lần 1: 2,81%; lần 2: 2,80%), 4 tuổi (3,24%).
- Hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin tích lũy trong củ Bình vôi S. glabra theo mùa trong năm
58
+ Hàm lượng alcaloid toàn phần ở củ cây trưởng thành theo mùa có sự khác nhau, mùa Thu là cao nhất và thấp nhất vào mùa Hạ cụ thể như sau: mùa Xuân (5,68 %), mùa Hạ (5,17 %), mùa Thu (5,98 %), mùa Đông (5,69 %).
+ Hàm lượng rotundin ở củ cây trưởng thành theo mùa có sự khác nhau, mùa Thu là cao nhất và thấp nhất vào màu Hạ cụ thể như sau: mùa Xuân (3,38%), mùa Hạ (3,19%), mùa Thu (3,67%), mùa Đông (3,57%).
59
ĐỀ XUẤT
- Trong phạm vi cho phép của đề tài chỉ xác định và lựa chọn được một số yếu tố chính trong quy trình nhân giống hữu tính Bình vôi S. glabra do vậy nên việc nghiên cứu bổ xung xác định các yếu tố ảnh hưởng khác để hoàn thiện quy trình nhân giống hữu tính tạo cây giống Bình vôi S. glabra đạt tiêu chuẩn chất lượng. - Đề xuất bổ sung điều kiện sắc ký đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống trong phương pháp định lượng rotundin ở củ Bình vôi S. glabra của chuyên luận dược liệu Bình vôi – DĐVN IV để đảm bảo tính đặc hiệu, tính đúng, độ lặp lại của phương pháp cụ thể bổ sung:
Phép thử định lượng rotundin trong củ Bình vôi S. glabra đạt yêu cầu khi: + Số đĩa lý thuyết của pic rotundin lớn hơn 10.000
+ Hệ số kéo đuôi của pic rotundin từ 0,8 – 1,2
+ Hệ số phân giải pic rotundin với pic liền trước và liền sau ở sắc ký đồ mẫu thử không nhỏ hơn 2
+ RSD (%) về thời gian lưu, diện tích pic của 5 lần tiêm mẫu chuẩn roduntin liên tiếp không lớn hơn 2.
- Tiếp tục theo dõi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin ở những cây trồng 5 năm trở lên để xác định thời điểm thu hoạch có hiệu quả kinh tế cao nhất.