n Khối lượgtươg đối (g/100g chuột) Tih
3.3.4.Kết quả mô bệnh học
Tiêu bản vi thể gan, thận được thực hiện và đánh giá tại Bộ môn Giải phẫu bệnh- Trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả cho thấy, sau 28 ngày cho uống mẫu thử liên tục:
- Cấu trúc thận ở trong giới hạn bình thường, không tăng sinh tế bào, không thấy hoại tử tế bào ống thận. Tuy nhiên có các ổ xâm nhập viêm (chủ yếu lympho bào) và tăng sinh xơ (viêm thận kẽ mạn tính mức độ vừa và nhẹ). Hình 3.2, hình 3.3, hình 3.4.
Hình 3.2. Cấu trúc vi thể thận lô chứng (HE x 100)
Nhu mô thận không viêm, không hoại tử, cầu thận không tổn thương
(a) (b)
Hình 3.3. Cấu trúc vi thể thận lô thử liều 1
(a): Trong mô đệm có các ổ xâm nhập viêm mạn tính (mũi tên). HE x 100 (b) Ảnh phóng đại ổ xâm nhập viêm mạn tính (mũi tên). HE x 400.
(c) (d)
Hình 3.4. Cấu trúc vi thể thận lô uống mẫu thử liều 2
(d) Ảnh phóng đại vùng xâm nhập viêm với nhiều lympho bào. HE x 400
- Trên hình ảnh vi thể gan, cấu trúc gan không bị đảo lộn, vẫn nhận rõ các tiểu thùy với tĩnh mạch trung tâm và các bè gan xếp hình nan hoa bánh xe. Tất cả vùng tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy và vùng gan khoảng cửa không xơ hóa, không xâm nhập viêm, không tăng sinh ống mật. Một số tế bào gan thoái hóa (chiếm khoảng 5- 15%) với các hình thái: thoái hóa nước, thoái hóa hạt, mất nhân, ít glycogen (hình 3.5, hình 3.6, hình 3.7).Tuy nhiên không có sự khác biệt về cấu trúc vi thể gan giữa lô dùng thuốc với lô chứng.
(e) (f)
Hình 3.5. Cấu trúc vi thể gan lô chứng
(e): Cấu trúc gan không đảo lộn, không hoại tử tế bào gan, không thấy xâm nhập viêm và tăng sinh xơ. HE x 100
(f): Một số tế bào gan thoái hóa nước, thoái hóa hạt (mũi tên đen). Một vài tế bào gan thoái hóa mất nhân (mũi tên xanh) HE x 400
(g) (h)
(g): Vùng có nhiều tế bào gan thoái hóa diện rộng, không hoại tử, không viêm. HE x 100
(h): Vùng có tế bào gan thoái hóa (mũi tên), không hoại tử, không viêm. HE x 400
(i) (k)
Hình 3.7. Cấu trúc vi thể gan lô uống cao TES liều 2
(i): Vùng có tế bào gan thoái hóa (mũi tên), không hoại tử, không viêm. HE x 100
(k): Vùng có tế bào gan thoái hóa (mũi tên), không hoại tử, không viêm. HE x 400
3.4. Bàn luận
Suy sinh dục nam với các biểu hiện như rối loạn cương dương, suy giảm khả năng tình dục, vô sinh… đã và đang là vấn đề sức khỏe được quan tâm. Các biện pháp điều trị suy giảm sinh dục nam hiện đang được áp dụng còn nhiều hạn chế một phần do nguyên nhân gây bệnh phức tạp, có thể kết hợp nhiều nguyên nhân và nhiều trường hợp nguyên nhân gây bệnh không rõ. Liệu pháp điều trị chủ yếu hiện nay là sử dụng testosteron thay thế (điều trị bằng testosteron) đã cải thiện được nhiều dấu hiệu của bệnh. Ngoài việc sử dụng các testosteron có nguồn gốc sinh học hoặc tổng hợp các dạng testosteron có nguồn gốc thực vật cũng được khai thác trong hỗ trợ điều trị suy sinh dục nam.
Theo kinh nghiệm dân gian có khá nhiều bài thuốc, vị thuốc đã được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ diều trị suy sinh dục nam như cá ngựa, đỗ trọng, nhục thung dung, ba kích, tọa dương, thỏ ty tử, bá bệnh…. [5], [19], [29]. Một số dược liệu trong số này cũng đã được nghiên cứu tác dụng tăng cường chức năng sinh sản nam như nhục thung dung, thỏ ty tử, bá bệnh,… [12], [33], [34], [35].
Xuất phát từ kinh nghiệm trong điều trị GS. Vũ Văn Điền bộ môn Y học cổ truyền trường đại học Dược Hà Nội đã thiết kế bài thuốc TES gồm các vị thuốc như sau: Bá bệnh 10g Xà sàng tử 12g Cốt khí củ 10g Đương quy 14g Bạch tật lê 12g Hoàng kỳ 14g Câu kỉ tử 16g Ba kích 10g
Theo y học cổ truyền, trong bài thuốc có 4 vị thuốc là bá bệnh, xà sàng tử, ba kích, và bạch tật lê có tác dụng bổ dương, đã được sử dụng nhằm tăng cường chức năng sinh dục nam. Một số nghiên cứu cũng đã cho thấy các dược liệu này có tác dụng cải thiện sự suy giảm chức năng sinh sản, sinh dục nam [12], [33], [40]. Đồng thời trong công thức bào chế TES đã có phối hợp thêm hoàng kỳ, đương quy, câu kỳ tử để bổ khí huyết, bổ can thận, thêm cốt khí củ làm tăng cường lưu thông máu và có tác dụng dược lý hướng sinh dục, tăng tác dụng bổ dương [27], [28], [29]. Sự kết hợp cả 8 vị như thế trong 1 bài thuốc với mong muốn vừa cải thiện chức năng sinh dục nam vừa bồi bổ cơ thể lẫn tăng cường lưu thông khí huyết thì tác dụng cải thiện sự suy giảm chức năng sinh sản, sinh dục sẽ tốt hơn. Đề tài được tiến hành để góp phần bước đầu chứng minh và làm sáng tỏ tác dụng tăng cường chức năng sinh sản nam cũng như bước đầu đánh giá khả năng gây độc (nếu có) của bài thuốc đối (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
với cơ thể động vật, đây là những cơ sở khoa học ban đầu nhằm từng bước đưa bài thuốc này vào áp dụng trên lâm sàng.
Nghiên cứu đã được thực hiện nhằm đánh giá hoạt tính androgen, độc tính cấp tính, độc tính bán trường diễn của bài thuốc. Để đánh giá hoạt tính androgen của mẫu thử chúng tôi đã tiến hành đánh giá trên 2 loại động vật là chuột cống đực non đã thiến và chuột cống đực trưởng thành không thiến.
Mô hình đánh giá tác dụng androgen của thuốc dựa trên việc đánh giá khối lượng các cơ quan sinh dục phụ đã được thực hiện từ những năm 1930. Đến năm 1953, Hershberger đã sử dụng mô hình này với một số thay đổi và bổ sung. Hiện nay, mô hình này được xem là mô hình thực nghiệm có giá trị nhất và được dùng phổ biến để chứng minh hoạt tính androgen của thuốc. Mô hình đánh giá tác dụng androgen của thuốc dựa trên việc đánh giá khối lượng các cơ quan sinh dục phụ bao gồm túi tinh, tuyến tiền liệt, tuyến cowper, cơ nâng hậu môn, quy đầu, tinh hoàn, đây là các cơ quan có sự phát triển phụ thuộc nhiều vào hoạt động của androgen. Khi khối lượng của hai hay trên hai cơ quan tăng lên có ý nghĩa thống kê so với lô chứng thuốc được coi là có hoạt tính androgen [45]. Theo OECD, nếu tiến hành đánh giá hoạt tính androgen trên nhóm đối tượng chuột nhắt đực thì có hai chỉ số không lấy được là tuyến tiền liệt và quy đầu do tuyến tiền liệt của chuột nhắt đực rất khó bóc tách một cách trọn vẹn vì tổ chức này quá mủn và nhỏ, nếu cố bóc tách sẽ cho sai số rất lớn về kết quả nghiên cứu. Quy đầu ở chuột nhắt không có mốc giải phẫu rõ ràng nên cũng cho sai số khá lớn khi tiến phân phân lập, bóc tách [45]. Từ những hạn chế đó, chúng tôi quyết định nghiên cứu trên nhóm đối tượng chuột cống trắng.
Tiến hành thí nghiệm trên chuột cống đực đã trưởng thành không thiến (giữa nguyên tinh hoàn), kết quả trình bày tại bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy ở cả 2 mức liều 6g/kg cân nặng và 12g/kg cân nặng chế phẩm TES đều thể hiện hoạt tính androgen. Với mức liều 6g/kg cân nặng TES làm tăng khối lượng tinh hoàn và cơ nâng hậu môn chuột thực nghiệm so với lô chứng (p<0,05) tuy nhiên nồng độ testosteron của lô chuột uống TES 6g/kg cân nặng lại chưa khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với lô chứng (p>0,05). Khi tăng liều lên gấp đôi (ở mức liều 12g/kg cân nặng) TES làm làm tăng rõ rệt túi tinh và cơ nâng hậu môn so với lô chứng (p<0,05) nhưng không làm tăng khối lượng tinh hoàn.
Trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng và độc tính của chế phẩm TES với mức liều cơ sở là 6g/kg cân nặng chuột cống.
Trên chuột cống đực non, tiến hành thiến chuột nhằm loại bỏ tinh hoàn, cơ quan chính trong cơ thể sản xuất testosteron. Nói cách khác mô hình này được tiến hành nhằm loại bỏ vai trò của testosteron nội sinh ngay từ khi các cơ quan sinh dục phụ chưa phát triển đầy đủ. Trong cơ thể, một trong những vai trò đặc biệt quan trọng của các androgen là tăng sinh, phát triển cơ quan sinh dục nam trong đó bao gồm cơ nâng hậu môn, tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến Cowper… vì vậy khi chuột chưa trưởng thành, nếu cắt bỏ tinh hoàn (thiến chuột) các cơ quan sinh dục phụ này sẽ rất nhỏ (do không phát triển được) và cụ thể kết quả thí nghiệm trình bày tại bảng 3.3 cho thấy khối lượng tương đối của các cơ quan sinh dục phụ ở chuột đực non thiến sau 17 ngày rất nhỏ so với chuột cống trưởng thành. TES với mức liều 6g/kg cân nặng không thể hiện hoạt tính androgen (không làm tăng khối lượng của các cơ quan sinh dục phụ: tuyến tiền liệt, tuyến cowper, túi tinh, cơ nâng hậu môn, qui đầu) Như vậy với kết quả đánh giá tác dụng của chế phẩm TES trên chuột cống đực non thiến và trên chuột cống đực trưởng thành không thiến có thể đưa ra nhận xét: có thể tác dụng của chế phẩm TES liên quan đến tác dụng trên tinh hoàn. Tuy nhiên để chứng minh tác dụng này cần tiến hành thêm các thí nghiệm sâu hơn để khẳng định.
So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với một số công bố trước đây về tác dụng tăng cường chức năng sinh sản nam của một số vị thuốc có trong thành phần của chế phẩm TES cho thấy:
Theo Dương Ly Hương dịch chiết nước bá bệnh với liều 10g/kg chuột nhắt trắng (tương ứng với 6g/kg thể trọng chuột cống trắng) có tác dụng androgen rõ thông qua việc làm tăng trọng lượng túi tinh, tuyến cowper và cơ nâng hậu môn lên một cách có ý nghĩa thống kê so với lô chứng trắng (với p < 0,05). Trên chuột cống
non thiến, dịch chiết nước bá bệnh với liều 6g/kg cân nặng, làm tăng đáng kể trọng lượng túi tinh, tuyến cowper, cơ nâng hậu môn và tăng nồng độ testosteron máu lên một cách có ý nghĩa so với lô chứng [12].
Ngoài tác dụng androgen, bá bệnh còn được chứng minh có một số tác dụng khác liên quan đến tăng cường chức năng sinh sản nam như làm tăng ham muốn tình dục nội tại: tăng hoạt động liếm dương vật, tăng số lần tiếp cận (MF) khi cho tiếp xúc với chuột cái [33]; tăng các hoạt động hướng về phía chuột cái (như tiếp cận, liếm, ngửi hít vùng âm đạo chuột cái)…, giảm các hoạt động hướng về môi trường như (khám phá, chạy, leo, trèo) [34].
Ba kích cũng có khả năng tăng cường hiệu lực của androgen trên chuột cống trắng đực [27].
Đối với Xà sàng tử, đã có một số tài liệu công bố về tác dụng trên chức năng sinh sản nam của một số dịch chiết hoặc chất chiết tách từ Xà sàng tử.. Khi cho chuột cống trắng uống coumarin toàn phần được chiết từ xà sàng tử với nồng độ 25mg/ml, 1ml/100g chuột hoặc dịch chiết nước từ xà sàng với nồng độ 25mg/ml, 100ml/g chuột 2 ngày liên tiếp đều có tác dụng đối kháng với những biểu hiện của chứng suy giảm sinh dục trên thực nghiệm do hydrocortison acetat [28]. Yuan (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của osthole, một chất được chiết từ Xà sàng tử lên nồng độ androgen và nitric oxid syntherase cho thấy osthole làm tăng nồng độ testosteron cũng như LH và FSH trên chuột cống thiến sau khi cho uống liên tục 20 ngày [50]. Nghiên cứu in vitro của Chen J năm 2000 đánh giá tác dụng của osthole trên cơ trơn thể hang của thỏ cô lập, kết quả cho thấy osthole có tác dụng làm giãn cơ trơn thể hang có thể do cơ chế tăng giải phóng nitric oxid từ nội mạc hoặc do ức chế phosphodiesterase [39].
Dịch chiết nước quả bạch tật lê cho chuột uống dài ngày có tác dụng tăng nồng độ testosteron trong huyết thanh, tăng hành vi tình dục như tăng tần suất tiếp cận với chuột cái, tăng số lần giao cấu [27].
Như vậy, tác dụng androgen của chế phẩm TES trong đó có chứa bá bệnh, ba kích, sà xàng tử, bạch tật lê là phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố trước
đây về tác dụng này của các dược liệu thành phần đã liệt kê ở trên. Tuy nhiên theo Dương ly Hương, rễ bá bệnh với liều 6g/kg cân nặng chuột cống làm tăng nồng độ testosterone trên chuột cống, trong nghiên cứu này chế phẩm TES ở liều 6g/kg cân nặng không thể hiện tác dụng này.
Về kết quả đánh giá độc tính: Để đánh giá độc tính cấp tính chúng tôi sử dụng phương pháp Litchfield-Wilcoxon và xác định được LD50 của chế phẩm là 33,47g/kg (31,75 g/kg – 34,47g/kg). Các biểu hiện độc tính cấp tính của chuột bao gồm: chuột giảm hoạt động, nằm một chỗ, lông xù, da và niêm mạc tím tái, chuột thở nhanh và nông, co giật trước khi chết. Với những chuột chết được mổ quan sát đại thể các cơ quan trong cơ thể kết quả cho thấy gan, thận, lách, tiêu hóa... bình thường nhưng tim và phổi có xung huyết rõ rệt. Theo Dương Ly Hương, dịch chiết nước bá bệnh cũng gây độc tính cấp tính với LD50 = 135,00 (116,38 - 156,60) g/kg; đa số các chuột chết đều có dấu hiệu tiêu chảy, không hoạt động, lim dim mắt (giảm hoạt động giống như đối với TES). Chúng tôi cũng tìm thấy một công bố về độc tính cấp tính của phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của câu kỷ tử trong đó cho thấy phân đoạn này không gây độc tính cấp tính. Không tìm thấy công bố về độc tính cấp tính của dịch chiết nước của các dược liệu khác có trong bài thuốc TES.
Về độc tính bán trường diễn: Để đánh giá độc tính bán trường diễn chúng tôi tiến hành trên chuột cống ở 2 mức liều 6g/kg cân nặng và mức liều gấp đôi (12g/kg cân nặng). Thông thường đối với các nghiên cứu đánh giá độc tính bán trường diễn, người ta thường đánh giá ở 2 mức liều: liều tương đương liều có tác dụng khi thử tác dụng dược lý và liều gấp 3 lần liều thứ nhất. Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi cũng đánh giá độc tính bán trường diễn của TES với 2 mức liều trong đó mức liều thứ 2 gấp đôi liều thứ nhất (liều có tác dụng dược lý). Lý do: Với liều 12g/kg cân nặng chuột cống lượng mẫu thử sau khi phân tán trong NaCMC 0,5% thu được hỗn dịch khá đặc, khi cho động vật thí nghiệm uống mẫu thử một số chuột đi phân đen (màu gần giống như màu cao thuốc), một số chuột có dấu hiệu đi phân lỏng hơn so với bình thường. Hơn nữa khi thử pha mẫu thử để đảm bảo cho chuột cống uống mẫu thử với liều 18g/kg cân nặng (liều gấp 3 liều 1), mặc dù đã tăng thể
tích thuốc cần phải cho uống lên tới 2ml/100g chuột/1 lần uống nhưng hỗn dịch mẫu thử vẫn rất đặc, rất khó cho uống và các chuột đều bị tiêu chảy ngay trong ngày đầu tiên cho uống mẫu thử vì vậy chúng tôi chỉ có thể thử độc tính bán trường diễn ở 2 mức liều là 6g và 12g/kg cân nặng chuột cống.
Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống bình thường mặc dù các lô chuột uống mẫu thử ít vận động hơn. Ở lô chuột uống chế phẩm TES liều cao (12g/kg cân nặng) một số chuột ỉa phân đen (màu giống cao thuốc không phải là máu) và một số bị tiêu chảy nhẹ. Về cân nặng: cân nặng chuột đều tăng ở các lô, các chuột lô uống TES cả 2 mức liều đều có xu hướng tăng chậm hơn lô chứng tuy nhiên sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê tại tất cả các thời điểm nghiên cứu (p>0,05).
Về các chỉ số huyết học: Tại thời điểm trước khi cho chuột uống mẫu thử (N0), sau khi cho chuột uống mẫu thử 14 ngày và 28 ngày số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và lympho bào ở các lô uống mẫu (ở cả hai mức liều 6g/kg và 12g/kg cân nặng) đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so với lô chứng tại cùng thời điểm (p>0,05). Tuy nhiên số lượng hồng cầu, hàm lượng hematocrit giảm nhẹ so với lô chứng ở cả 2 lô chuột uống mẫu thử liều 1 và liều 2 tại thời điểm 14 ngày sau uống mẫu thử khi so sánh với lô chứng tại cùng thời điểm (p<0,05). Đối với hàm lượng hemoglobin và số lượng tiểu cầu, kết quả thí nghiệm cũng cho thấy hàm lượng hemoglobin và số lượng tiểu cầu giảm ở lô chuột cống uống TES liều cao