Các polimerase tham gia vào quá trình tái bản ADN và phiên mã tổng hợp ARN và được sử dụng nhiều trong kĩ thuật di truyền. Các pohmeasase gồm 2 nhóm: (1) ADN-polimerase xúc tác tổng hợp chuỗi polinucleotit theo chiều từ 5'
đến 3'. Taq polimerase (enzyme tách từ vi khuẩn suối nước nóng) có khả năng chịu nhiệt, sử dụng trong phản ứng chuỗi PCR. Enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase: RT-ase) xúc tác tổng hợp CADN từ khuôn ARN; (2) Các ARN-polimerase tham gia tổng hợp ARN. Ngoài các enzyme trên còn có nhiều enzyme tham gia sửa chữa những sai sót trên phân tử ADN.
2.1.1. Taq polimerase
Taq polimerase được tách chiết từ một loại vi khuẩn Thermus aquaticus
suối nước nóng. Taq polimerase được sử dụng trong PCR và RAPD tổng hợp
đoạn ADN trong điều kiện có dung dịch đệm, Mg+ primers. Hiện nay các nhà khoa học có thể phân lập gene xác định enzyme polimerase, tách dòng và biểu hiện gene này. Chính vì vậy bằng công nghệ ADN tái tổ hợp có thể tạo ra lượng lớn enzyme Taq polimerase sử dụng trong kĩ thuật di truyền.
2.1.2. ADN-polimerase I
của exonuclease 5' → 3' và 3' → 5'. Enzyme này xúc tác phản ứng thay thế sợi, trong phản ứng đó chức năng exonuclease 5' → 3' phân huỷ sợi không làm khuôn trong khi polimerase tổng hợp bản sao mới. Chức năng exonuclease 5'→3' của ADN polimerase I có thểđược loại bỏ bằng cách cắt enzyme để tạo ra
đoạn Klenow. Đoạn này vẫn duy trì các hoạt tính polimerase và exonuclease 3'→ 5'. Đoạn Klenow được sử dụng khi cần sao chép một phân tử ADN mạch
đơn.
2.1.3. Enzyme phiên mã ngược
Enzyme phiên mã ngược được phát hiện từ 1970 có chức năng tổng hợp ADN từ ARN. Trong tự nhiên, enzyme này do Retrovirus sản sinh để phiên mã ngược từ hệ gene ARN của chúng để thực hiện quá trình xâm nhập vào hệ gene của tế bào chủ. Reverse Transcriptase được sử dụng trong kĩ thuật tạo cADN bằng phản ứng PCR ngược (RT-PCR). Hiện nay người ta sử dụng các loại enzyme phiên mã ngược như: Avian Myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMV-RT) và Moloney Murine Leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV- RT), trước đây AMV-RT phải tách chiết từ virus Myeloblastosis gia cầm, còn M-MLV-RT từ virus gây bệnh Leukemia ở chuột. Các enzyme này là sản phẩm của gene pol của virus và hiện nay các enzyme này đã nhận được từ công nghệ
ADN tái tổ hợp.
Enzyme phiên mã ngược là một ADN-polimerase phụ thuộc ARN, vì vậy nó sản sinh ra sợi ADN từ sợi khuôn ARN. Nó không có hoạt tính exonuclease kèm theo. Enzyme này chủ yếu được sử dụng để sao chép các phân tử mARN khi chuẩn bị cADN (ADN bổ trợ hoặc ADN bản sao) để tách dòng, mặc dù nó cũng có tác động trên khuôn ADN.
2.1.4. T4 ADN-polimerase
Enzyme T4 ADN-polimerase có nguồn gốc từ phage T4 kí sinh trong tế
bào vi khuẩn. Hoạt tính của enzyme này giống như hoạt tính đoạn Klenow và
được sử dụng trong tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao. Bởi vì hoạt tính exonuclease 3'-5' mạnh hơn T4 ADN-polimerase.
2.1.5. Terminal transferase
Enzyme Terminal transferase được li trích từ tuyến ức bò, có chức năng xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotit vào đầu 3'-OH tự do của ADN. Terminal transferase được sử dụng khi thêm đuôi polinucleotit để tạo đầu so le cho ADN trong kĩ thuật tạo dòng.
2.1.6. Enzyme Alkaline phosphatase
Enzyme Alkaline phosphatase được phân lập từ E. coli hay từ ruột bò. Chức năng của enzyme này là loại bỏ nhóm 5' phossphate của ADN, ARN và
các nucleotit tự do. Enzyme Alkaline phosphatase sử dụng để loại bỏ
5'phossphate của ADN và ARN trước kho đánh dấu phóng xạ bằng 32P; sử dụng trong kĩ thuật tạo dòng, khi vector được "mở" bởi RE và enzyme làm mất 5' phosphate để vector không thể nối lại được.
2.1.7. Enzyme T4 polinucleotit kinase
Enzyme T4 polinucleotit kinase có nguồn gốc từ phagene T4 kí sinh trong
E. coli. Chức năng của enzyme T4 polinucleotit kinase ngược lại với Alkaline phosphatase, xúc tác cho phản ứng thêm vào nhóm phosphate ở đầu 5' của ADN hay ARN. T4 polinucleotit kinase sử dụng để đánh dấu phóng xạ ở đầu 5' của ADN trong kĩ thuật xác định trình tự ADN và phosphoryl hoá các trình tự ADN không có nhóm phosphate ởđầu 5' để chuẩn bị cho phản ứng nối của kĩ thuật tạo dòng.
2.2. Enzyme nối ADN-ligase
Enzyme nối ADN-ligase xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn ADN và ARN.
ADN-ligase là một enzyme nối quan trọng trong tế bào vì chức năng của nó là sửa chữa các mối liên kết photphodiester bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên hoặc trong tái bản ADN hay tái tổ hợp ADN. ADN-ligase được sử dụng trong kĩ
thuật tạo dòng và thường được kết hợp với các enzyme Alkaline phosphatase và polinucleotit kinase. Nhóm enzyme ligase được sử dụng nhiều nhất trong các thí nghiệm với ADN và ARN chủ yếu gồm E. coli ADN-ligase, T4 ADN-ligase và T4 ARN-ligase. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.1. E. coli ADN-1igase
Enzyme E. coli ADN-ligase được tách chiết từ E. coli, xúc tác cho các
phản ứng nối hai trình tự ADN có đầu dính (so le).
Hình 4.9. Enzyme E. coli xúc tác phản ứng nối hai trình tự có đầu dính
2.2.2. T4 ADN - ligase
Enzyme T4 ADN-ligase chiết từ phage T4 kí sinh ở E. coli, xúc tác cho
dòng.
2.2.3. T4 ARN-ligase
Enzyme T4 ARN-ligase chiết từ phage T4 kí sinh ở E. coli, xúc tác cho
phản ứng nối hai trình tự ARN bằng liên kết phosphodiester. Enzyme T4 ARN- ligase thường được sử dụng để đánh dấu phóng xạ ở đầu 3' của ARN trong kĩ
thuật sản xuất mẫu dò (probe).
Như vậy, enzyme ligase có hiệu quả trong sự gắn các khe hở của các trình tự có đầu dính hoặc đầu bằng với nhau trong những điều kiện thích hợp. Nhiệt
độ thích hợp là 370C, nhưng nó có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiều (4 15÷ 0C).
§3. ENZYME NUCLEASE