§3. ENZYME NUCLEASE
§4. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH ENZYME
enzyme và phân tích phổ enzyme. Có thể tiến hành xác định hoạt độ của enzyme thông qua định lượng hoặc định tính. Đó là xác định lượng cơ chất bị phân giải trong một đơn vị thời gian, hoặc xác định thời gian phân giải trong cùng lượng cơ chất, đo vòng phân giải.... Kết quả xác định hoạt độ enzyme sẽ cho thấy mối quan hệ giữa hoạt độ của loại enzyme nào đó với đặc tính nghiên cứu. Dưới đây giới thiệu một vài phương pháp xác định hoạt độ của enzyme.
Ở thực vật, khi hạt nảy mầm thì enzyme hoạt động mạnh. Hoạt độ của enzyme tăng dẫn đến sự biến đổi các chất dự trữ. Mức độ hoạt hoá các enzyme phụ thuộc vào tính chất và thành phần hoá học của hạt. Đối với các cây họ Đậu chất dự trừ chủ yếu là protein cho nên hoạt tính protease mạnh hơn các enzyme khác. Kết quả là protein bị phân giải thành các axit amin, các axit amin có thể được sử dụng tổng hợp nên các protein thứ cấp cấu trúc nên chất nguyên sinh của phôi hạt sinh trưởng và cây non, cũng có thể kết hợp với NH3 để tạo nên các amít, đặc biệt là sự nảy mầm của hạt trong tối. Ngoài protein, trong hạt đậu xanh còn có tinh bột, do đó hoạt tính α - amylase ở cây họ Đậu cũng khá cao. Sự tăng hoạt độ α- amylase sẽ làm tăng hàm lượng đường do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng giữ nước. Người ta đã nghiên cứu thấy α - amylase, hàm lượng đường và áp suất thẩm thấu có mối tương quan thuận. Người ta đã nghiên cứu thấy rằng đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của cây đậu tương có khả
năng chịu hạn, chịu nóng có liên quan đến vai trò của a-amylase và protease. Hạt sau khi được ngâm nước với nhiệt độ thích hợp và đủ O2 thì các enzyme bắt đầu hoạt động phân giải các chất hữu cơ. Quá trình phân giải protein và tinh bột diễn ra rất phức tạp.
Enzyme α -amylase thuộc nhóm hyđrolaza có trong nước bọt, hạt hoà thảo nảy mầm, tụy tạng, trong nấm mốc, vi khuẩn. Enzyme α-amylase phân giải các liên kết 1,4- glucozit ở giữa chuỗi mạch polisacarit, tạo thành các đextrin phân tử thấp. Do đó dưới tác dụng của enzyme này dung dịch tinh bột nhanh chóng bắt màu với dung dịch iot và bị giảm độ nhớt mạnh. Ion canxi có tác dụng làm bền cấu trúc không gian của phân tử enzyme. Enzyme α - amylase tương
đối bền với nhiệt hơn các amylase khác nhưng lại kém bền với axit.
Protease cũng thuộc nhóm hydrolaza phân giải các liên kết peptit ở giữa chuỗi mạch polipeptit nên còn gọi là endo peptit hydrolaza. Protease đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sống. Chúng không chỉ tham gia vào phân giải protein dự trữ trong hạt nhằm cung cấp các axit amin cho thời kì phát triển đầu tiên của cây mà chúng còn tham gia vào quá trình xử lí phân tử protein và hoạt
hoá các enzyme khác. Ngoài ra, protease còn tham gia phân giải các protein lạ
hoặc bị biến tính khi gặp điều kiện cực đoan như lạnh, hạn, mặn,... Protease trong hạt có thểđược tổng hợp từ trước ở dạng tiền chất và tồn tại song song với protein dự trữ, cũng có thể được tổng hợp mới trong quá trình hạt nảy mầm. Sự
có mặt của protease trong hạt dự trữ protein của hạt đang nảy mầm là bằng chứng về sự tham gia của chúng vào quá trình phân giải protein, các sản phẩm peptit trong các bào quan đó. Quá trình phân giải protein dự trữ của các cây họ Đậu đều giống nhau. Khi protein bị phân giải hết những không bào lớn được hình thành trong các tế bào dự trữ. Các axit amin được tạo ra trong quá trình này
được sử dụng để sinh tổng hợp các protein mới trong mầm non. Quá trình biến
đổi protein dưới xúc tác của protease diễn ra đầu tiên là : protein dự trữ ở dạng nguyên thuỷ bị endopeptidaza đặc hiệu cắt một số mối liên kết trên bề mặt của phân tử globulin theo cơ chế "khoá kéo". Sau đó có sự thay đổi cấu trúc không gian của globulin và làm cho chúng trở thành cơ chất dễ phân giải bởi endopeptidaza khác và các exopeptidaza có sẵn trong protein dự trữ trong hạt, tạo thành các polipeptit, oligopeptit ngắn hơn. Tiếp theo, các sản phẩm này bị
aminopeptidaza phân giải đến axit amin.
Định lượng hoạt độ enzyme α - amylase theo phương pháp Heinkel được thực hiện theo nguyên tắc là: xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở
xác định mức giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iot. Đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 300C.
Dựa vào tính chất hoà tan trong dung môi hữu cơ, chiết enzyme a- amylase bằng dung dịch đệm photphat xitrat pH = 6,8. Đem cân mẫu và nghiền nhỏ tròng dung dịch đệm photphat xitrat, li tâm lạnh 12000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch chứa enzyme α- amylase cho vào tube nhựa để làm thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành ở ống thí nghiệm, ống kiểm tra, ống đối chứng. Trong ống thí nghiệm, cho 0,25ml tinh bột 1% vào 0,25ml NaCl 0,1% tiếp tục cho thêm 0,5ml dung dịch đệm photphat xitrat pH = 6,8 và 0,25ml dịch chứa enzyme, sau đó lắc đều và để trong tủ ấm 300C trong 30 phút. Sau khi để tủ ấm lấy ra cho thêm 1,25ml dung dịch axit sunfosalisihc 20%, lắc đều. Lấy 1ml từ hỗn hợp trên cho thêm 9ml iot loãng 150 lần lắc đều để 10 phút rồi đo trên máy quang phổ UV Visible Spectrophotometers ở bước sóng 560 nm.
Ống kiểm tra: tương tự ống thí nghiệm chỉ khác là cho 1,25ml dung dịch axit sunfosalisilic 20% vào trước sau đó mới cho dịch chứa enzyme và để trong tủ ấm 30 phút. ống đối chứng: tương tự như ống thí nghiệm chỉ khác là thay dịch chứa enzyme bằng nước cất.
Kết quả: lấy kết quả ống kiểm tra trừ đi ống thí nghiệm nhân với độ pha loãng, tìm được số mg tinh bột bị thuỷ phân bởi dịch chiết chứa enzyme α - amylase trong 30 phút ở 300C.
Cho hỗn dịch (thạch agar, tinh bột, nước) vào bình nón, đun cách thuỷ cho tan thạch, đổ vào đĩa petri dày 4mm, để nguội, đục lỗ đường kính (d-mm). Nhỏ
100 l dịch chiết chứa enzyme vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 30
μ
0C trong 24 giờ. Nhuộm lugol trong 5 phút và tráng bằng NaCl 1N. Đo đường kính vòng phân giải (D-mm). Hoạt tính enzyme a-amylase được xác định bằng: D - d (mm).
Xác định hoạt độ enzyme protease theo phương pháp anson cải tiến theo nguyên tắc: dùng cazein làm cơ chất; sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng axit tricloaxetic. Xác định hoạt độ phân giải protein của enzyme trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-ciocalteau. Cân mẫu và nghiền nhỏ trong dung dịch đệm photphat pH = 6,5. Li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Dịch thu được sử dụng làm thí nghiệm như sau:
Ống thí nghiệm: cho 1ml cơ chất đã đạt 300C trong 10 phút trộn với 0,5ml dịch chứa enzyme protease đã đạt 300C trong 10 phút, sau đó cho thêm 2,5ml tricloraxetic 5%, lắc đều để 30 phút ở 300C. Lọc lấy 0,5ml dịch lọc và cho thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều rồi cho 0,5ml thuốc thử Foling- Ciocalteu. Để hỗn hợp trên 30 phút rồi đo trên máy quang phổ UV Visible Spectrophotometers ở bước sóng 720nm.
Ống kiểm tra: sau khi cho 1ml dung dịch cơ chất, cho ngay 2,5ml dung dịch axit tricloaxetic 5%, lắc đều rồi mới cho 0,5ml dung dịch chứa enzyme protease. Các bước tiếp theo làm tương tự như ởống thí nghiệm. ống đối chứng: làm tương tự như trên chỉ thay dung dịch chứa enzyme bằng nước cất.
Cho hỗn dịch (thạch agar, cazein, nước) vào bình nón, đun cách thuỷ cho tan thạch, đổ vào đ a petri dày 4mm, để nguội, đục lỗ đường kính (d-mm). Nhỏ
100μl dịch chiết chứa enzyme vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzyme khuếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Nhuộm lugol trong 5 phút và tráng bằng NaCl 1N. Đo đường kính vòng phân giải (D-mm). Hoạt tính protease được xác định bằng: D-d (mm).
Phân tích isozyme với mục tiêu là phát hiện hoạt tính của một loại enzyme nào đó. Tuy nhiên trong phân tích di truyền, người ta căn cứ vào kết quả
phân tích phổ isozyme mà đánh giá được sự đa dạng sinh học của các loài sinh vật nghiên cứu và xác định được mối quan hệ về di truyền mức độ sai khác giữa
các đối tượng nghiên cứu.
Đại đa số các enzyme có bản chất là protein, cho nên thông thường người ta phân tích phổ isozyme bằng điện di trên gel acrylamid. Căn cứ vào hoạt động của loại enzyme đó mà người ta trộn thêm cơ chất của enzyme đó vào gel. Trong điều kiện nhiệt độ thích hợp sau khi chạy điện di mà enzyme cần phân tích sẽ hoạt động tương tác với cơ chất. Căn cứ vào kết quả nhuộm gel mà phát hiện ra phổ isozyme của loại enzyme đó. Cũng có thể sử dụng màng nitrocellulose để phát hiện hoạt động của enzyme.
§5. NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT