Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCHDÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE
§3. BIỂU HIỆN GENE
3.1.1. Các hệ biểu hiện gene
Trong tế bào sống, biểu hiện gene được hiểu là quá trình sinh tổng hợp protein trong mối liên hệ: ADN → ARN → Protein và protein là sản phẩm biểu hiện gene. Trong kĩ thuật di truyền, biểu hiện gene là hiện tượng protein của gene ngoại lai được tổng hợp trong tế bào chủ.
Hiện nay có 4 hệ sau hay sử dụng biểu hiện gene như Escherichia coli, Bacillus subtilis, nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) và tế
bào động vật. Tuy nhiên E. coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện đang
được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng.
Cho đến nay có thể nói rằng vấn đề biểu hiện gene ngoại lai vẫn còn mang tính thực nghiệm đối với từng gene, chưa có một mô hình chung cho phép biểu hiện tối ưu đối với các loại protein khác nhau trong một biểu hiện. Vì vậy, đểđạt
được mức độ biểu hiện cao đối với một gene ngoại lai. trong nhiều trường hợp phải nghiên cứu thăm dò với các yếu tố khác nhau để tìm ra diều kiện tối ưu.
Các protein biểu hiện trong các tế bào khác nguồn gốc có thể được chia thành 4 nhóm chính:
Nhóm thứ nhất bao gồm các peptit nhỏ có độ dài dưới 80 axit amin. Đây là đoạn peptit được biểu hiện dễ dàng nhất dưới dạng protein dung hợp (fusion
protein) và thường được biểu hiện trong tế bào E. coli.
Nhóm thứ hai là các chuỗi polipeptit thường được tiết ra ngoài tế bào (như
enzyme, cytokin, hormon...) có kích thước trong khoảng 80-500 axit amin. Các protein thuộc nhóm này có thể biểu hiện được trong cả 4 hệ biểu hiện.
Nhóm thứ 3 gồm các protein tiết và protein đóng vai trò thụ thể trên bề
mặt tế bào có kích thước hơn 500 axit amin.
Nhóm thứ tư bao gồm tất cả các protein không tiết có kích thước lớn hơn 80 axit amin.
Hầu hết các protein đều có thể được biểu hiện trong tế bào E. coli nếu protein đó không quá nhỏ hoặc quá lớn, hoặc quá kị nước, hoặc chứa quá nhiều gốc cystein. Các protein nhỏ và polipeptit thường không bền vững trong tế bào chủ nên muốn biểu hiện tốt trong E. coli thì cần được gắn với một đoàn protein khác. Đoạn protein này sẽ giúp cho đoàn peptit dược bền vững trong tế bào E.
coli sau đi được tổng hợp và hiện nay nó có còn được dùng như một dấu nhận biết tinh chế protein lai này. Sở dĩ các protein có chứa nhiều gốc cystein và cầu disulfit không được biểu hiện tốt trong E. coli là do môi trường bên trong tế bào
E. coli có tính khử cao.
B. subtilis và nấm men mặc dù không phải là hệ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu để biểu hiện gene ngoại lai như E. coli nhưng những hệ biểu hiện này cũng có nhiều ưu điểm đáng chú ý. Điển hình là B. subtilis có khả năng biểu hiện và tiết rất tốt protein có nguồn gốc từ Prokaryot ra ngoài môi trường nuôi cấy còn nấm men lại có những ưu điểm quan trọng của cả Eukaryot và Prokaryot. Nấm men sinh trưởng nhanh và có khả năng chế biến protein sau khi dịch mã rất tốt để trở thành dạng protein hoạt động mà hệ biểu hiện gene ở vi khuẩn không có. Hơn nữa nấm men có mức độ an toàn sinh học cao, được sử
dụng nhiều trong công nghiệp dược liệu và thực phẩm. Vì vậy, nấm men rất
được ưa chuộng để biểu hiện các gene của Eukaryot và gene mã hoá cho protein sử dụng trong thực phẩm và chữa bệnh.
Hệ biểu hiện trong tế bào động vật có khả năng biểu hiện được tất cả
protein của 4 nhóm nhưng tốn thời gian và quá trình chọn lọc, nhân dòng và nuôi cấy dòng tế bào phức tạp hơn nên hệ biểu hiện này thường không được sử
dụng rộng rãi.
Những đặc tính sinh học phân tử đểđiều chỉnh sự biểu hiện gene thể hiện
ở (1) Đặc điểm tự nhiên của những trình tự promotor và terminator liên quan
đến dịch mã; (2) Độ mạnh yếu và vị trí bám của ribosome; (3) Số phiên bản của gene tách dòng; (4) Vị trí tổng hợp protein trong tế bào, (5) Hiệu suất của quá
trình giải mã trong tế bào chủ; (6) Sự bền vững của phân tử protein được mã hoá bởi gene tách dòng trong tế bào chủ.
Mức độ biểu hiện gene ngoại lai (foreign gene) còn phụ thuộc vào sự
nhận biết của cơ thể vật chủ. Hiện nay đã có phổ rất rộng các cơ thể biểu hiện gene ngoại lai (cả Prokaryot và Eukaryot) nhưng đa số các sản phẩm được sản xuất bởi công nghệ ADN tái tổ hợp được tổng hợp ở E. coli.
3.1.2. Biểu hiện gene từ những promotor mạnh và điều khiển được
Yêu cầu tối thiểu với một hệ thống biểu hiện gene có hiệu quả là sự có mặt của một trình tự promotor mạnh và có thể điều khiển được (strong and regulatable promotor) nằm ở phía trước gene tách dòng.
Promotor mạnh là một promotor có ái lực cao với enzyme ARN polimerase và sẽ bảo đảm cho trình tự nằm sau promotor dược phiên mã với tần suất cao. Khả năng điều khiển promotor đã cho phép tế bào chủ kiểm soát quy mô phiên mã một cách chính xác. Promotor lac-operon đã được sử dụng rộng rãi trong việc biểu hiện gene tách dòng. Ngoài ra nhiều promotor đã được phân lập từ nhiều cá thể khác nhau để sử dụng trong biểu gene. Phương pháp tối ưu hoá sự biểu hiện của gene tách dòng là gắn gene đó vào plasmid dưới sự kiểm soát của promotor phiên mã liên tục và mạnh. Tuy nhiên, sự biểu hiện liên tục và ở
mức độ cao của một gene ngoại lai thường gây hại cho tế bào chủ vì nó gây ra sự thiếu hụt năng lượng, mất cân bằng trong tế bào là suy giảm những chức năng thiết yếu của tế bào. Đồng thời một số hay toàn bộ các plasmid chứa gene tách dòng sẽ bị mất đi sau một số lần phân chia tế bào. Những tế bào không chứa các plasmid mang gene tách dòng sẽ phân chia mạnh hơn các tế bào chứa plasmid mang gene tách dòng và các tế bào không chứa các plasmid mang gene tách dòng sẽ chiếm ưu thế. Điều này đã cản trở quá trình biểu hiện và sản xuất các sản phẩm từ gene tách dòng. Để khắc phục khó khăn này người ta có ý tưởng mong muốn kiểm soát được sự phiên mã của gene táchdòng ở mức chỉ cho gene này biểu hiện ở một giai đoạn sinh trưởng hất định của tế bào. Sử dụng một promotor mạnh và điều khiển được sẽ là giải pháp thực hiện mong muốn đó. Promotor mạnh và điều khiển được đang sử dụng rộng rãi là promotor của operon lac và tryp của E. conli Promotor lac được thiết kế và chế tạo invitro chứa:
- Vùng -10 của lac promotor. - Vùng -35 của tryp promotor.
- Promotor bên trái (pL) của bacteriophage λ - Promotor gene 10 của bacteriophage T7.
Mỗi promotor này tương tác với chất ức chế và nhờ đó có thể tắt hoặc mở
sự phiên mã của những gene tách dòng. Mỗi promotor lại dược nhận ra bởi cấu trúc của ARN polimerase holoenzyme nhờ nhân tố σ (nhân tố σ bám vào lõi của ARN polimerase để hình thành holoenzyme, định hướng cho enzyme bám vào những vùng promotor).
Promotor lac bị ức chế (tắt) bởi protein kìm hãm lac khi môi trường thiếu lactose và được mở bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy lactose hoặc isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Lactose và IPTG bán vào promotor lac và quá trình phiên mã sảy ra. Quá trình phiên mã từ promotor lac còn được điều khiển bởi protein hoạt hoá chuyển hoá (catabolite activator protein-CAP). Khi CAP bám vào promotor lac sẽ làm tăng ái lực của promotor với enzyme phiên mã.
Promotor tryp bị ức chế bởi phức hệ protein kìm hãm, phức hệ này bám vào operator tryp và ngăn can quá trình phiên mã. Promotor mở bằng việc loại bỏ tryptophan hoặc thêm vào môi trường axit 3-indoleacrylic.
Promotor pL được kiểm soát bởi protein kim hãm cI của bacteriophage λ. Promotor của bacteriophage T7 đòi hỏi phải có enzyme polimerase T7 ARN để
thực hiện phiên mã.
3.2. Kĩ thuật biểu hiện gene
Gene được biểu hiện là gene đã được phân lập và đã biết trình tự. Các gene này có thể được phân lập bằng các phương pháp khác nhau. Sau khi có
đoạn gene mong muốn chúng sẽ được biểu hiện trong các hệ thích hợp theo các bước các cạnh.
Bước 1: Lựa chọn hệ thích hợp để biểu hiện gene.
Bước 2: Dựa vào trình tự gene, thiết kế các đoạn mồi để nhân gene. Tổng hợp mồi.
Bước 3: Chuẩn bị ADN không để nhân gene.
Bước 4: Nhân gene bằng PCR từ ADN hệ gene của vi khuẩn hoặc từ ngân hàng cADN nhưng tốt nhất là nhân gene trực tiếp từ chính plasmid mang gene
đã từng dùng đểđọc trình tự gene đó.
Bước 5: Đưa gene vào vector tách dòng và biến nạp vào tế bào E. coli để
khuếch đại dòng gene.
Bước 6: Tách plasmid từ các thể biến nạp E. coli. Kiểm tra gene trong vector tách dòng bằng enzym hạn chế. Kiểm tra gene và đặc biệt là chiều của gene trong vector biểu hiện. Gene cần biểu hiện phải nằm đúng chiều của prromotor.
Bước 7: Đưa gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào E. coli..
Bước 9: Biến nạp vector biểu hiện có mang gene vào tế bào chủ (E. coli
hoặc nấm men). Bắt đầu từ bước này, các thao tác để biểu hiện gene ở các chủng khác nhau là khác nhau.
Bước 10: Kiểm tra sự biểu hiện của gene.
3.2.1. Lựa chọn hệ biểu hiện
E. coli và Nấm men là hai hệ được sử dụng nhiều trong kĩ thuật biểu hiện gene. E. coli được dùng để biểu hiện rất nhiều gene có nguồn gốc cả từ
Prokaryot và Eukaryot. Nấm men là cơ thể có ích được sử dụng rất rộng rãi để
sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp dùng làm dược liệu để chữa bệnh và cả
protein dùng trong công nghiệp thực phẩm. Các gene khi được biểu hiện trong tế
bào E. coli tránh được hiện tượng protein bị glicosil hoá, trong khi đó ở nấm men lại có hiện tượng glicosil hóa. Tế bào E.coli sinh trưởng nhanh, thuận tiện cho các thao tác sinh học phân tử nên E. coli cũng thường được chọn để biểu hiện gene dùng cho những mục đích nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, việc biểu hiện các đoạn gene lớn trong tế bào E. coli có những hạn chế như protein tái tổ
hợp bị tồn tại ở dạng không tan, dạng thể vùi và không được tiết ra ngoài môi trường. Ở nấm men các protein tái tổ hợp này thường được tiết ra ngoài môi trường rất hiệu quả, có độ tinh sạch cao và đảm bảo hoạt tính sinh học của chúng. Men có thể biểu hiện và tiết tốt các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật, thực vật bậc cao, nấm và vi khuẩn ra ngoài môi trường.
3.2.2. Thiết kế mồi để nhân gene
Mồi dùng để nhân gene bằng PCR là một cặp mồi (mồi xuôi và ngược
được thiết kế để bám vào vùng tận cùng ở 2 đầu của gene cần nhân.
Trước khi thiết kế mồi để nhân gene, việc đầu tiên quan trọng là phải kiểm tra trình tự gene, quyết định đoạn gene cần nhân để đưa vào biểu hiện và kiểm tra các điểm cắt của enzyme hạn chế trong đoạn gene. Để tiện cho việc đưa gene vào vector biểu hiện, các đoạn mồi nhân gene thường được thiết kế có chứa thêm trình tự của enzyme hạn chếở 2 đầu tận cùng của gene. Khi đó gene có thể được cắt trực tiếp bằng các enzyme này để dưa vào vector biểu hiện. Trình tự
enzyme hạn chế được đưa thêm vào mồi cũng được lựa chọn rất kĩ càng. Trước hết các trình tự này phải có mặt trong vùng đa nối (polilinkers, multiple cloning sites) của vector biểu hiện. Tiếp theo, các trình tự này phải là trình tự rất hiếm gặp ở trong gene cần biểu hiện (tốt nhất là trình tự này không có mặt trong gene cần biểu hiện). Trình tự enzyme được thêm vào mồi xuôi nên là trình tự enzyme giới hạn đứng ngay đầu 5' của vùng đa nối còn enzyme hạn chế được thêm vào mồi ngược là trình tự enzyme đứng tận cùng đầu 3' của vùng đa nối. Nếu 2 mồi
có thêm 2 enzyme giới hạn khác nhau thì enzyme giới hạn ở mồi xuôi phải đứng trước cnzyme giới hạn ở mồi ngược trong vùng đa nối, tính theo chiều promotor
đểđảm bảo đoạn gene đưa vào sẽ nằm xuôi chiều với promotor.
Mồi luôn được thiết kế và được ghi theo chiều từ 5' đến 3' của gene. Mồi xuôi có trình tự tương đồng với đoạn trình tự của sợi không mã hoá (sợi antisense). Đoạn trình tự tương đồng thường được sử dụng ở mỗi mồi để đảm bảo kết cặp đặc hiệu là khoảng trên 15 nucleotit trở lên. Tận cùng đầu 5' của mồi nên để dư ra ít nhất một nucleotit đểđoạn gene nhân lên có trình tự được nguyên vẹn. Nucleotit dư ra ở đầu 5' không nên là nucleotit có khả năng bắt cặp tương
đồng tốt với nucleotit ở tận cùng đều 3' trên cùng đoạn mồi, kích thước đoạn mồi cũng không nên quá dài. Tối thiểu chỉ cần 18 nucleotit của đoạn mồi bắt cặp chính xác với đoạn gene cần nhân là được. Tất nhiên độ dài của đoạn mồi có thể
thay đổi phụ thuộc vào tỉ lệ các gốc A, T tại vị trí trong đoạn gene mà đoạn mồi cần bắt gặp.
Sau khi thiết kế được mồi, việc quan trọng là kiểm tra sự dịch mã của
đoạn gene sẽ được nhân lên bằng 2 mồi vừa thiết kế trong vector biểu hiện. Khung đọc của gene phải được đảm bảo một cách nghiêm ngặt.
3.2.3. Chuẩn bị ADN khuôn để nhân gene
Để nhân được gene bằng PCR, nguyên liệu đầu tiên cần phải chuẩn bị đó là ADN khuôn.
3.2.4. Nhân gene bằng PCR
Trước hết, sợi ADN khuôn phải được biến tính để sợi ADN khuôn trở
thành dạng sợi đơn. Sau đó việc tổng hợp và nhân gene diễn ra với khoảng 25 - 30 chu kì. Sau khi kết thúc các chu kì trên, mẫu được ủ ở 750C trong khoảng 3
đến 6 phút, sau đó giữ mẫu ở 40C.
Để tiến hành nhân gene bằng PCR, ngoài 2 đoạn mồi và ADN sợi khuôn ra thì phức hợp mẫu được trộn còn có nước khử ion vô trùng, 4 loại deoxyribonucleotit, Taq DNA polimerase hoặc Vent polimerase, đệm thích hợp cho Taq polimerase hoặc Vent polimerase, MgCl2. Thông thường MgCl2 có sẵn trong đệm nên có thể không cần phái bổ sung thêm nữa. Nồng độ MgCl2ở trong mẫu càng lớn thì càng làm tăng khả năng bắt cặp không đặc hiệu của mồi. Taq polimerase tổng hợp gene có dư ra một nucleotit A ởđầu 3' còn Vent polimerase tổng hợp gene cho đầu bằng. Vì vậy, tuỳ theo điều kiện tách dòng mà chọn Taq hay Vent cho PCR. Nếu sản phẩm PCR được đưa vào vector tách dòng là đầu bằng thì nên chạy PCR bằng Vent. Vent ít gây ra sai sót trong trình tự gene được nhân hơn Taq. Nếu sử dụng một số vector tách dòng được mua từ các hãng, các vector này đã được thiết kế ở dạng thẳng và có dư nucleotit T có khả năng kết
cặp tương đồng với nucleotit A dư ra ở sản phẩm PCR thì nên sử dụng Taq polimerase.
Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose. ADN tích điện âm có khả năng chuyển động trong điện trường theo chiều từ cực âm tới cực dương. Tốc độ
chuyển động phụ thuộc vào 2 yếu tố: dạng tồn tại của ADN và kích thước ADN. Các ADN có kích thước lớn sẽ chuyển động chậm trong gel agarose còn ADN có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn. CÁC ADN ở dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn ADN dạng thẳng. Từ một phạm vi nhất định phụ thuộc vào nồng độ gel agarose, kích thước phân tử tuyến tính với quãng đường địch chuyển của ADN trên gel agarose. Thường các đoạn gene có kích thước từ 300
đến 10000bp có thể được phân tách trên gel agarose 0,8%. Đoạn gene càng nhỏ
thì nồng độ agarose càng phải tăng lên và để phát hiện các đoạn gene nhỏ tới vài chục nucleotit hoặc một chuỗi nhỏ nucleotit người ta thường phải sử dụng gel poliacrylamid. Các đoạn gene trên gel agarose được phát hiện bằng cách nhuộm với EtBr hoặc bằng đánh dấu phóng xạ. Thông thường nhất là các đoạn gel được nhuộm bằng ethidium bromit và được phát hiện bằng đèn chiếu tia UV.
