§3. ENZYME NUCLEASE
NHÂN BẢN CÓ CHỌN LỌC
3 0.522727 3 1.000000 0 ML59 0.7954545 0.7727273 0.431818 0.690909 0.522727 1.000000 ML48 0.7500000 0.8636364 0.477272 0.691818 2 0.522727 3 0.818181 8 1.00000 00 Hình 7.9. Sơđồ phả hệ của các dòng đậu tương đột biến chọn lọc từ giống gốc Các vệ tinh cũng như chỉ thị phân tử khác như đa hình độ dài các phân
đoạn ADN (RFLP), các đoạn ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) đã
được sử dụng rộng rãi để thiết lập bản đồ phân tử chi tiết và định vị các gene
điều khiển các tính trạng giá trị ở cây đậu tương (Keim và cộng sự, 1990; Diers và cộng sự, 1992; Yu và cộng sự, 1994). Shoemaker and Specht (1995) đã thông báo sáp nhập các nhóm liên kết cổ điển với các nhóm liên kết di truyền phân tử ở cây đậu tương bằng cách sử dụng 20 1ocus cổ điển, 8 1ocus chỉ thị phân tử
RAPD và 110 1ocus chỉ thị phân tử RFLP.
§4. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CHIỀU DÀI CÁC PHÂN ĐOẠN ADN
ĐƯỢC NHÂN BẢN CÓ CHỌN LỌC
(Amplified Fragment Length Polimorphism - AFLP)
Zabeau và Vos (1993), Vos và cộng sự (1995) đã đưa ra và mô tả một kĩ
thuật mới về in dấu vân ADN. Đó là kĩ thuật khuếch đại chọn lọc các đoạn ADN
lọc các đoạn ADN đa hình từ hệ gene. Kĩ thuật khuếch đại có chọn lọc các đoạn ADN hiện nay là một kĩ thuật có sức mạnh lớn và đầy tiềm năng về in dấu vân ADN. Nó tạo ra một cách nhanh chóng nhất, hiệu quả nhất một bản đồ di truyền dày đặc các chỉ thị phân tử nhằm chọn lọc các tính trạng mong muốn thông qua chọn giống nhờ các chỉ thị phân tử đồng thời là một công cụ lí tưởng đối với việc xác định và đánh giá cây trồng ở mức độ phân tử ADN. Các nhân tố AFLP là những chỉ thị phân tử, nhanh chóng được áp dụng vào việc nghiên cứu di truyền, lập bản đồ gene, dán nhãn gene quan trọng ở nhiều loài thực vật khác nhau như khoai tây (Ballvoro và cộng sự, 1995; Folkertsma và cộng sự, 1996), lúa mạch (Becker và cộng sự, 1995). Kĩ thuật phân tích ADN đa hình có chọn lọc (hay là kĩ thuật khuếch đại chọn lọc các đoạn ADN đa hình - AFLP) gồm 3 bước cơ bản sau đây:
(1) Phân cắt phân tử ADN bằng enzyme giới hạn tiếp theo là gắn kết chất gá (adapter).
(2) Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polimerase để khuếch đại các đoạn ADN.
(3) Phân tích các đoạn ADN trên gel poliacrylamid.
Do có sự phối hợp các loại enzyme, giới hạn khác nhau với nucleotit chọn lọc của chất mồi nên kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại này cho phép tạo ra nhiều các chỉ thị phân tử hơn so với các phương pháp trước đó.
Bằng các nhân tố RFLP và AFLP K. Meksem và cộng sự (1995) trong chiến lược phân lập các diễn chống chịu bệnh sương mai (Phytophthora Infestans) ở cây khoai tây đã thành công thiết lập bản đồ gene có độ phân giải cao về vùng phụ cận locus R1 trên nhiễm sắc thể số 5. Các tác giả đã góp phần chọn lọc một cách gián tiếp các giống khoai tây có khả năng chống bệnh sương mai thông qua chọn giống nhờ các chỉ thị phân tử (Marker Assisted Selection - MAS).
D. J. Mackill (1996) đã sử dụng các chỉ thị phân tử AFLP, RAPD và trình tự nucleotit lặp lại đơn giản (Microsatellite) để nghiên cứu mức độ đa hình trên 14 giống lúa khác nhau và cho rằng các chỉ thị phân tử AFLP và trình tự
nucleotit lặp lại đơn giản có thể được xem như là các chỉ thị phân tử bổ sung cho việc lập bản đồ gene ở nhiều loại cây trồng nói chung cũng như ở cây lúa nói riêng, đồng thời các chỉ thị phân tử này cũng tỏ ra thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ các locus điều khiển tính trạng số lượng thông qua con lai bắt nguồn từ 2 loài phụ Japonica và Indica. Ngoài ra các chỉ thị phân tử AFLP trở nên cần thiết
đoạn nhiễm sắc thể đặc hiệu với nhiều số lượng các chỉ thị phân tử (Thomas và cộng sự, 1995).
Sự khám phá ra các đại phân tử axit nucleic và protein - cơ sở vật chất chủ
yếu của sự sống và nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn bằng các kĩ thuật hiện đại trên cơ sở sự phát triển của sinh học phân tử. Trong công nghệ sinh học thực vật. việc phân loại genome trong tế bào thực vật và mối quan hệ giữa chúng làm sáng tỏ vai trò vật liệu di truyền thực vật, những hiểu biết về axit nucleic và hệ
gene trong tế bào thực vật là nền tảng cho các kĩ thuật sinh học phân tử.
Các kĩ thuật sinh học phân tử được ứng dụng trong phân tích genome thực vật. Trong các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng vào chọn tạo giống cây trồng thì các kĩ thuật PCR và RAPD có thể được ứng dụng rộng rãi và, hiệu quả trong
điều kiện Việt Nam. Bằng kĩ thuật RAPD, dựa vào sản phẩm điện di lập bảng thống kê các phân đoạn ADN được nhân bản, từ đó thiết lập biểu đồ so sánh sự
khác nhau ở mức phân tử giữa các dòng và các giống với nhau. Những kết quả
bước đầu vềứng dụng kĩ thuật PCR và RAPD cho phép khẳng định hiệu quả của sự kết hợp phương pháp chọn giống truyền thống với những phương pháp sinh học phân tử hiện dại trong tạo giống cây trồng, vật nuôi.
THẢO LUẬN
1. Trình bày cơ sở, nguyên tắc của phản ứng chuỗi PCR và những ứng dụng của PCR.
2. PCR trong phân tích hệ gene của sinh vật và trong công tác chọn giống.
3. RAPD là gì? Phương pháp xác định dấu chuẩn RAPD và quan hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp RAPD.
Chương 8