§5. NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT

§3. ENZYME NUCLEASE

§5. NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT

đánh dấu. Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:

Bước 1: Tách protein bằng điện di trên gel poliacrylamid.

Bước 2: Chuyển protein từ gel sang màng (PVDF) nhờđiện trường.

Bước 3: Nhuộm màng bằng kháng thểđặc hiệu.

Bước 4: Nhuộm màng bằng cộng hợp (kháng thể kháng kháng thể gắn enzyme).

Bước 5: Bổ sung cơ chất cho enzyme chuyển hóa để có thể nhìn thấy vệt protein phản ứng với kháng thểđặc hiệu trên màng.

Enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành hợp chất có màu có thể nhìn thấy trên màng. Như vậy chỉ vệt protein nào phản ứng với kháng thể thì mới hiển thị

trên màng.

Hình 5.7. Sơđồ phân tích Western blot

hoạt ribosome (RIPs) tipe I là một họ protein tương đối đồng nhất, kiềm tính, khá bền vững. Tuy nhiên chúng vẫn rất khác nhau về đặc tính enzyme và hoạt tính sinh học. Do có các đặc tính sinh - dược học cũng như khả năng ứng dụng rất đa dạng, cho nên việc tìm kiếm những loại RIPs mới có những tính chất lí thú vẫn đang tiếp diễn ở rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Ở nước ta tuy chưa nhiều nhưng đã bắt đầu có những công bố về loại protein này từ nguồn thực vật. Dưới đây là kết quả khảo sát sự phân bố của RIPs tipe I bằng kĩ thuật Western blot trên một số đối tượng thực vật (thuộc họ Cucurbitaceae) như: cây

Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98 thu thập ở Bắc Kạn, cây Hồng qua (Mảnh bát -

Coccinia cordifolia Cugn.), Gấc (Momordica conchinchinensis), Dưa chuột

(Cucumis sativus L.), Mướp đắng (Momordica charantia), Thiên hoa phấn (rễ

của Trichosanthes kirilowii Maxim).

Để tiến hành việc khảo sát và xác định RIPs, protein tổng số từ các mẫu rễ, hạt được chiết rút, dịch chiết protein được lọc qua màng milipore 0,2μm. Protein được tủa lại bằng acetone lạnh theo tỉ lệ 1:1 (w/v) ở 40C. Các bước điện di protein bằng SDS-PAGE (12,5% acrylamide) được tiến hành theo các phương pháp của Laemmli, sau đó thực hiện phương pháp Western blot.

Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng Trichobakin tái tổ hợp với các mẫu protein trên là rất đặc hiệu và chỉ có ở vùng 23 - 30 kDa.

THẢO LUẬN

1. Trình bày đặc điểm và vai trò của một số protein liên quan đến tính chịu nhiệt ở thực vật.

2. Protein bất hoạt ribosome RIPs, phương pháp khảo sát RIPs và ứng dụng của những nghiên cứu này.

3. Xác định mối liên quan giữa protein và tính trạng có thể tiến hành theo quy trình nào?

4. Phương pháp phân tích chỉ thị phân tử protein được phân tách bằng điện di.

Chương 6

KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE Ở SINH VẬT

Tóm tắt: Sinh học phân tử là nòng cốt của công nghệ sinh học. Phân tích sinh học phân tử được bắt đầu từ việc thu nhận dịch chiết ADN từ tế bào sống đủ

sạch để thực hiện các phân tích tiếp theo. Tuỳ theo vật liệu nghiên cứu mà có phương pháp tách chiết ADN phù hợp. Dung dịch ADN sau khi kiểm tra hàm lượng và độ sạch được sử dụng để phân tích theo những mục đích khác nhau như Southem blot, Northem blot, xác định trình tự ADN, PCR, RFLP, AFLP,...

Nội dung của chương gồm 5 vấn đề cơ bản: (1). Phương pháp tách chiết ADN, (2). Lai phân tử, (3). Xác điịh trình tự nucleotit, (4). Kĩ thuật RFLP, (5). Trình tự

nucteotit lặp lại.

Thành tựu của sinh học hiện đại và những hiểu biết về di truyền học phân tử làm cơ sở cho việc nghiên cứu, xây dựng các kĩ thuật sinh học hiện đại. Những kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phân tích genome của sinh vật

đã được công bố trong các tạp chí khoa học và các sách chuyên khảo.

§1. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN