§3. ENZYME NUCLEASE
NHIÊN (RANDQM AMPLIFIED PQLIMORPHIC DA N- RAPD)
ADN dựa trên phản ứng khuếch đại phân đoạn ADN ngẫu nhiên bằng các đoạn mồi có trình tự ADN tuỳ ý. Kĩ thuật này được gọi là kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình (RAPD technology).
Hiện tượng đa hình các đoạn ADN khuếch đại ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotit tại vị trí các đoạn mồi liên kết (chẳng hạn đột biến điểm) hoặc do biến đổi các nhiễm sắc thể trong khu vực gene khuếch đại (lồng đoạn, mất đoạn). Phương pháp này đơn giản về mặt kỹ thuật, tiến hành nhanh chóng và chỉ cần một lượng rất ít phân tử ADN (nanogram). Các đoạn ADN đa hình được khuếch đại là một loại chỉ thị phân tử đặc thù mà chúng có thể phát hiện hiện tượng đa hình giữa các cá thể khác nhau ở mức độ phân tử
ADN.
Các mồi có trình tự nucleotit ngắn (10 nucleotit) liên kết bổ trợ với nhiều locus khác nhau và có khả năng khuếch đại nhiều đoạn ADN khác nhau (từ 2
đến 10 đoạn ADN khác nhau) trong một phản ứng dây truyền dùng enzym polimeraza. Kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình đã được sử
dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền các hệ thống sinh học. Kĩ thuật này tỏ ra rất hữu ích đặc biệt trong các trường hợp nơi mà không có sẵn các chỉ thịđồng enzyme (isozyme) hoặc các nhân tốđánh dấu RFLP.
Hình 7.5. Sơ đồ phương pháp RAPD (theo CIMMYT, 1997 và Đinh Thị Phòng, 2001)
Các yếu tố cắn thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: (1) ADN khuôn mẫu (DNA template) với nồng độ 5-50ng trong 25 l; (2) Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10 nucleotit, trong đó C+G chiếm 50-80%; (3)ADN-polimeraza (Taq polimeraza): hoạt động của Taq polimeraza phụ thuộc vào Mg
μ
2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; (4) Bốn loại deoxynucleotit triphotphat (dNTP): ATP, TTP, GTP: CTP; (5) Ion Mg2+.
Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn giống như PCR:
- Giai đoạn biến tính ADN: ở nhiệt độ 950C trong khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn ADN tách nhau.
- Giai đoạn tiếp hợp mồi: Khi nhiệt độ hạ xuống 32-400C mồi tiếp hợp và bám vào sợi ADN khuôn.
- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taq polimeraza. Sau một chu kì gồm 3 giai đoạn như trên, một đoạn ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kì lại được coi là ADN khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Vậy sau k chu kì nhân bản sẽ tạo ra 2k các đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu. RAPD có thể thực hiện từ
40-45 chu kì.
Kĩ thuật này khác với kĩ thuật PCR ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên, số
chu kì nhiều hơn và ở giai đoạn 2 nhiệt độ hạ thấp xuống 32-360C, không đòi hỏi thông tin về trình tự ADN được nhân bản.
Dựa trên sự xuất hiện hay biến mất của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RAPD được quan sát thấy ở các cá thể khác nhau và được đánh giá theo quy ước 1 = xuất hiện và 0 = không xuất hiện. Một bảng gồm các giá trị 0 và 1 được thiết lập từ các cá thể nghiên cứu sẽ cho phép tính ra hệ số tương
đồng di truyền của các cặp theo Nei và Li.
Trong quá trình thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài, một số
tác giả (Apostol và CS, 1993) đã xây dựng kĩ thuật phân nhóm thông qua các biểu đồ RAPD (RAPD Lot). Thực chất kĩ thuật này gồm 3 bước:
Bước 1: So sánh từng cặp đối tượng trong nghiên cứu bằng cách tính toán khoảng cách quan hệ giữa chúng.
Bước 2: Lập một ma trận gồm tất cả những giá trị tính toán được trước
đó.
Bước 3: Giải ma trận và biểu diễn thành một biểu đồđặc trưng.
Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập được phần mềm máy tính để tự động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tương đồng di truyền của các đối tượng nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn được nhân bản của các cá thể. NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics lúc., USA., 1998) là tên của một chương trình thuộc kiểu trên để lập ra biểu đồ hình cây Biểu đồ hình cây thu
được sẽ thể hiện mức độ gần nhau của các cá thể cho phép đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể được nghiên cứu. Chương trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu và có độ chính xác cao nên nó là một phần mềm
có hiệu quả trong việc phân tích kĩ thuật RAPD.
Đối với đa số thực vật, các đoạn mồi dài khoảng 10 nucleotit với 60% GC sẽ tạo ra 2-10 sản phẩm được nhân bản. Hiện tượng đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotit tại vị trí các
đoạn mồi liên kết. Vì vậy các đa hình thường được nhận ra do có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locut. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng, chỉ cần một lượng nhỏ (nanogram) phân tử ADN có nguồn gốc từ hệ
gen. Các đoạn ADN đa hình được nhân bản là một loại chỉ thị phân tử đặc thù mà chúng ta có thể phát hiện hiện tượng đa hình giữa các cá thể khác nhau ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mức độ phân tử ADN. Kĩ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả
trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền.
Người ta đã áp dụng thành công kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình vào nhiều lĩnh vực khác nhau, như lập bản đồ gen, in dấu ván ADN, chọn giống...
Lập bản đồ gene (Gene Mapping)
Các nhân tố RAPD cũng phân li theo quy luật Mendel và có thể được sử
dụng như các gene đánh dấu di truyền trong việc thiết lập các bản đồ phân tử
(Williams và cộng sự, 1990; Foolad và cộng sự, 1993). So với kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình độ dài các phân đoạn ADN (RFLF Technology) thì kĩ thuật này có một số ưu điểm nổi bật là: có thể phát hiện hiện tượng đa hình trong phân tử ADN trên một phạm vi rộng lớn hơn; tính đơn giản và nhanh gọn; cần ít lượng ADN. Kĩ thuật này đã được áp dụng thành công vào nhiều loại cây trồng khác nhau để thiết lập các bản đồ di truyền phân tử như Brassica (Quyros và cộng sự 1991), Arabidopsis thaliana (Reiter và cộng sự, 1992) cà chua (Klein Lankhorst và cộng sự, 1991; Foolad và cộng sự, 1993)...
In dấu vân ADN(ADN Fingerprinting) xác định bản đồ giống ở mức độ
Hình 7.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD ởđậu tương và đậu xanh
(1. ADN marker, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Sản phẩm RAPD)
Hình 7.7. Quy trình sử dụng kĩ thuật phân tích RAPD
sử dụng tác nhân tố RAPD làm cho kĩ thuật này trở hấp dẫn trong nghiên cứu nhận dạng các cá thể, chẩn đoán các bệnh di truyền, phân loại thực vật và tiến hoá ở mức độ phân tử, các mối quan hệ phát sinh chủng loại trong giới tính. Trong phạm vi giới thực vật kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình đã được sử dụng để nhận dạng các giống cây trồng (cây hoa lơ - Hu và Quyros, 1991; cây cần tây - Yang và Quyros, 1993), phát hiện mối quan hệ phát sinh chủng loại (bèo hoa dâu - Van Coppennolle và cộng sự, 1993; Scroch và cộng sự, 1992; ngũ cốc - Dweikat và cộng sự, 1993), đánh giá giống và sự đa dạng di truyền trong tập đoàn giống cây trồng (lúa mì - Vierling và Nguyen, 1992; Caetano - Anolles và cộng sự, 1991). Zheng và cộng sự (1991) khi sử
dụng hai đoạn mồi khác nhau đã phát hiện các chỉ thị phân tử RAPD trong tập
đoàn 19 giống lúa và chỉ ra tính hữu hiệu lớn lao của các chỉ thị phân tửđó trong việc nhận dạng giống.
Hình 7.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD ở lạc (a) và lúa cạn (b)
Fukuoka và cộng sự (1992) đã xác định các đoạn ADN đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên ở 16 giống lúa khác nhau và cho rằng chúng khác biệt nhau bởi ít nhất là một băng ADN đa hình và phân bố trong ba nhóm lúa khác nhau tương ứng với các loại phụ Japonica, Javanica và Indica. L. X. Yu và H. T. Nguyen (1993) đã nghiên cứu sự biến dị di truyền của các giống lúa cạn thông qua sử dụng tới 42 đoạn dò ADN khác nhau. Các tác giả đã thu được 260 đoạn gene khuếch đại khác nhau, trong số đó thì 208 đoạn gene (tức là 80%) thể hiện sự đa hình và xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa đó.
David. J. Mackill (1995) cũng bằng kĩ thuật này đã thành công xác định sự đa dạng di truyền của 134 giống lúa có nguồn gốc khác nhau và chỉ ra rằng sự biến dị di truyền của các nhân tố RAPD là rất quan trọng bổ sung thêm cho việc lập bản đồ gene và in dấu vân ADN.
Dán nhãn gene (tagging Genes)
dụng một cách thành công để đánh dấu (dán nhãn) các gene điều khiển các tính trạng quan trọng của cây trồng, chẳng hạn như gene quy định tính chống chịu bệnh đốm vi khuẩn ở cây cà chua (Martin và cộng sự, 1991), gene quy định khả
năng chống bệnh giun tròn ở cây cà chua (Klein - Lankhorst và cộng sự, 1991), gene chống bệnh gỉ sắt.
Kĩ thuật RAPD còn được ứng dụng trong chọn giống. Việc xác định các chỉ thị RAPD đặc trưng. làm cơ sở cho chọn giống gián tiếp. Căn cứ vào sản phẩm điện di RAPD người ta có thể thiết lập bảng thống kê sự có mặt các phân
đoạn ADN được nhân (số 1 : có mặt đoạn ADN; số 0: đoạn ADN không được nhân). Trên cơ sở đó xác định dược hệ số đồng dạng di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu, lập sơ đồ phả hệ (cây phát sinh). Từ kết quả đó sẽ xác định
được sự sai khác về bộ gene của các đối tượng nghiên cứu.
Bảng 7.1. Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD
Các dòng đột biến và giống gốc Các đoạn
mồi kích thƯớc lượng ước (kb) Đoạn được nhân Giống gốc ML81 ML10 ML61 ML70 ML59 ML48 8,0 1 1 1 0 0 0 1 1 7,0 2 1 1 0 0 0 1 1 6,0 3 1 1 0 0 0 1 1 RA 31 5,1 4 1 1 0 0 0 1 1 5,0 5 0 0 1 1 1 0 0 4,9 6 1 1 1 1 1 1 1 4,8 7 0 0 1 1 1 0 0 2,5 8 0 0 1 0 1 0 1 2,0 9 0 0 1 0 1 0 0 1,9 10 0 0 1 0 1 0 0 1,5 11 1 1 1 1 1 1 1 1,49 12 0 0 0 1 0 0 0 1,48 13 0 0 0 1 0 1 1 1,43 14 1 1 1 0 1 0 0 1,40 15 0 0 1 0 1 0 0 1,38 16 0 0 1 0 1 0 0 1,35 17 0 0 1 0 1 0 0 1,33 18 0 1 1 1 0 1 1 1,2 17 0 1 0 1 0 0 1 0,98 20 0 0 1 0 1 1 0 0,83 21 0 0 1 0 1 0 0 0,60 22 0 1 0 0 0 1 1
Bảng 7.2. Hệ số đồng dạng di truyền của các dòng đậu tương Dòng ĐB và G.gốc Giống gốc Lạng Sơn ML81 ML10 ML61 ML70 ML59 ML48 G.Gốc 1.0000000 ML81 0.7954545 1.000000 ML10 0.5000000 0.5681818 1.000000 ML61 0.5681818 0.7272727 0.704545 1.000000 0