§3. ENZYME NUCLEASE
§1. PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR)
Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại invitro một trình tự ADN lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene (đột biến điểm, tái tổ
hợp, retrovirus) từ những đoạn ADN ngắn được phân lập hoặc từ một lượng rất nhỏ lấy ra được khuếch đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp.
Đồng thời nó giúp cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự
ADN trong bộ gene của các cơ thểsinh vật khác nhau.
Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện khi có ADN mẫu, 2 đoạn mồi (mỗi
khuẩn Thermus aquaticus):,bốn loại deoxyronucleotit triphotphate ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và con Mg2+ Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện trên thiết bị nhân ADN (máy PCR).
Hình 7.1. Thiết bị nhân ADN (Máy PCR)
Kĩ thuật PCR là một phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích hệ gen. Sử dụng kĩ thuật PCR có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của đoạn ADN cần tổng hợp mà không phải tách và nhân dòng. Thực chất PCR là một phương pháp invitro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban dầu hạn chế. Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polimerase, hỗn hợp bốn tiền chất deoxynucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hoá trị 1, ion Mg2+ và dung môi (nước khử
ion khử trùng).
Enzyme Taq polimerase là enzyme chịu nhiệt, được tách từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Enzyme Taq có trọng lượng phân tử là 94 kDa và không mất hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN. Hoạt tính của enzyme Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt 92,50C; sau 40 phút ở
nhiệt độ 950C và sau 5-6 phút ở nhiệt độ 970C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C trong 20 giây để biến tính ADN kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzyme Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng.
Nồng độ enzyme Taq tối ưu cho phản ứng PCR là 0,5-2,5 đơn vị, nhưng nếu nồng độ enzyme quá cao sẽ làm giảm hiệu suất xúc tác của phản ứng. Ngoài ra, nồng độ Mg2+ và dNTP cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Hiện nay, có nhiều loại polimerase chịu nhiệt khác có chức năng riêng biệt và hoàn thiện hơn như Tth polimerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt
động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt của ARN khuôn và ion Mg2+.
ADN khuôn (template)
sạch cao. ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADN được biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Thông thường, nồng độ của ADN khuôn
được đưa vào phản ứng PCR khoảng 10-500ng.
Đoạn mồi (primer)
Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 4-10 bazơ (đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12-24 bazơ (đối với mồi đặc trưng). Nồng độ
mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5μM. Lượng mồi đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng ADN cần tổng hợp (thường 106 phân tử
ADN cần 108 phân tử mồi). Nếu nồng độ mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trước khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ mồi quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không
đặc hiệu.
Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Mồi phải được thiết kế sao cho không được bổ trợ lẫn nhau, số lượng 4 loại bazơ
nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, lượng G-C giữa hai mồi phải bằng nhau, tránh những vùng trình tự không bình thường như polipurine hoặc poliprimidine hay các trình tự lặp.
Các nucleotit (dNTPs)
dNTPs là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN. Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã được thay
đổi như gắn thêm biotin hoặc digoxygenin... Nồng độ phản ứng của các dNTP thường dùng vào khoảng 200mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10- 100mM) Taq ADN polimerase hoạt động chính xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối
ưu của chúng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: Nồng độ Mg2+ nồng độ chất mồi, độ dài của sản phẩm được khuếch đại số chu kì của phản ứng.
Thành phần của dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzyme polimerase
được sử dụng. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg2+ làm tăng nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzyme polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5-5,5mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng
độ lớn Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme polimerase, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhìn chung, nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Ngoài Mg2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm như
AMSO, DMSO, formamide được thêm vào như các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước lớn.
Mỗi một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:
(1) Giai đoạn tách chuỗi ADN: ADN bị biến tính từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn ờ nhiệt độ 94-950C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1-1,5 phút).
(2). Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 400- 650C cho phép hai đoạn mồi gắn vào ADN mẫu ở vị trí tương đồng theo nguyên tắc bổ sung (A - T, G - C) ở hai đầu ADN cần nhân.
(3) Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 720C ADN Taq polimerase hoạt động kéo dài đoạn ADN từ đoạn mồi và hai đoạn ADN mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn ADN khuôn ban đầu.
Sau một chu kì gồm ba giai đoạn như trên, một đoạn ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kì lại được coi là ADN khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì nhân bản sẽ tạo ra 2K đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu.
Kĩ thuật phản ứng di truyền dùng polimerase là kĩ thuật tương đối đơn giản và phân tích một cách nhanh chóng sự biến dị di truyền ở mức độ phân tử
ADN trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể (Innis và cộng sự, 1990). PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích genome của sinh vật, vì nó có khả
năng tạo ra một lượng lớn các trình tự ADN đặc hiệu từ bất kì cơ thể nào. PCR
được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như xác định trình tự trực tiếp của ADN được nhân bản, thiết kế các trình tự ADN mới, nhân bản quần thể ADN để
làm mẫu lai, xác định các trình tự đặc hiệu từ cADN hay thư viện gene, phân tích tiến hoá và sự đa dạng ADN của quần thể sinh vật hay giữa các cá thể. Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác và tương đối đơn giản để đánh giá cây chuyển gene, phân tích một cách nhanh chóng sự biến dị di truyền
ở cấp độ phân tử ADN trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể.
Hình 7.2. Sơđồ phản ứng chuỗi polimerase (PCR)
định mà từ đó người ta thiết kế và tổng hợp các đoạn mồi (đoạn khởi đầu cho tổng hợp ADN). Tuy vậy sau này các nhà sinh học phân tử đã cải tiến kĩ thuật này mà không cần thiết phải biết trước trình tự chuỗi ADN. John Welsh và Michael Mc Clelland đã sử dụng kĩ thuật PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên trong việc xác định in dấu genome. Kĩ thuật PCR được ứng dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm và phân tích ADN đa hình. PCR còn được ứng dụng phân lập gene, phân tích sinh vật chuyển gene. Ở Việt Nam các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập các gene liên quan đến khả năng chống chịu ở
cây trồng, như gene chịu hạn ở cây lúa (Lê Trần Bình và cộng sự, 1998), gene chịu nóng ở đậu tương (Trần Phương Liên và cộng sự, 1999),... và hàng loạt các gene đã được tách và giải trình tự nucleotit.
Hình 7.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (Đinh Duy Kháng, 2002)
1.2. Phản ứng RT-PCR (PCR ngược)
1.2.1. Nguyên lí
Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự từ khuôn ARN, gồm 2 giai đoạn: (1) Tổng hợp trình tự ADN 2 sợi từ sợi ARN làm khuôn; (2) Trình tự ADN 2 sợi lại làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR.
Phản ứng biến đổi ARN thành ADN phải nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse-trancriptase) được gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở
nhiệt độ 500C - 550C trong 30 phút. Sau khi có sản phẩm ADN 2 sợi thì phản
ứng tiếp theo là PCR thông thường gồm 3 giai đoạn. RT-PCR được sử dụng để
nhân ARN của retrovirut hoặc mARN tách từ tế bào chất.
1.2.2. Tiến hành phản ứng RT- PCR
- Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kì, thực hiện sao chép ngược từ ARN sợi đơn sang ADN sợi kép ở nhiệt độ 500C- 550C, trong 30 phút.
- Giai đoạn 2 (PCR): (1). Biến tính ở nhiệt độ 940-950C /1phút; (2).Tiếp hợp mồi ở 40-650C; (3). Tổng hợp ADN ở 720C/1 phút.
1.3. Kiểm tra sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR cùng với ADN marker được kiểm tra bằng phương pháp
điện ới trên gel agarose 0,8-2%. Tiến hành chụp ảnh trên ánh sáng đèn UV để (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 7.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR (Đinh Duy Kháng, 2002)
1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Kết quả của phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của các yếu tử như: ADN khuôn, Taq polimerase, primer và nhiệt độ nóng chảy của mồi, ton Mg++, nguyên liệu là các dNTP, nước, dung dịch đệm,...
1.5. Các lĩnh vực ứng dụng của phản ứng PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, từ khi được Kary Mullis đề xuất hoàn thiện, đã có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cả
trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội.
Trong nghiên cứu, kĩ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotit của các đoạn ADN được nhóm có thể sử dụng PCR để phát hiện đột biến, PCR cho phép phân tích liên kết gene từ những tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hoá ở mức phân tử, thậm chí phục hồi những gene đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm.
Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng, đặc biệt đối với động vật và thực vật bậc cao, vốn trước đây việc lựa chọn cặp cha mẹ làm giống là rất khó khăn. cần nhiều năm, thì nay kĩ thuật PCR cho phép thực hiện chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ.
Trong y học PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ
virut đến vi khuẩn và các bệnh do nấm, kể cả HIV-AIDS, chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung thư...
Trong tư vấn di truyền y học PCR cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác các bệnh di truyền kể cả chẩn đoán trước sinh giới tính và các dị tật bẩm sinh có thể có từ khi thai mới được 8 tuần tuổi và điều quan trọng là không cần chọc ối, chỉ cần lấy một giọt máu ngoại vi của mẹ để làm mẫu thí nghiệm.
Ngày nay kĩ thuật PCR là không thể thiếu trong khoa học hình sự, giúp chẩn đoán nhanh, chính xác thủ phạm chỉ từ một vết máu khô, một sợi tóc hoặc một sinh phẩm nào đó mà thủ phạm để lại trên hiện trường. Ngoài ra kĩ thuật này còn cho phép xác định chính xác quan hệ huyết thống cha - con, ông - cháu... cũng chỉ trong vài giờ.
Trong bảo vệ môi trường, việc xác định mức độ ô nhiễm sinh học có thể
thực hiện rất hiệu quả và nhanh chóng bằng kĩ thuật PCR.
Những ứng dụng thực tiễn đa dạng của phản ứng chuỗi trùng hợp PCR thật vô cùng tận. Nếu như năm 1985 mới có 3 công trình được công bố về PCR thì 5 năm sau kĩ thuật này đã được sử dụng trong hàng nghìn phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Ngay ở nước ta, kĩ thuật PCR cũng đã và đang được dùng trong nhiều trường đại học, viện nghiên cứu và ngày càng trở nên phổ biến. Phản ứng chuỗi trùng hợp thật sự đã đưa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực
ứng dụng thực tế của di truyền học phân tử.
Tóm lại, những ứng dụng cơ bản của PCR có thể tóm tắt như sau: - Sản xuất mẫu dò.
- Khuếch đại số lượng các đoạn ADN và ARN. - Định lượng bằng PCR.
- Phân tích đột biến. - Phân tích ADN đa hình.
- Phân lập gene và tách dòng gene. - Phân tích sinh vật chuyển gene.
§2. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN NGẪU NHIÊN (RANDQM AMPLIFIED PQLIMORPHIC DAN - RAPD)