ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.5.5. Tỷ lệ sống của tinh trùng (Sg)
Phương pháp tiến hành
Dùng một phiến kính đã rửa sạch sấy khô, lấy một giọt tinh nhỏ lên phiến kính, sau đó lấy một giọt thuốc nhuộm xanh methylen 5% nhỏ bên cạnh giọt tinh dịch. Dùng đũa thủy tinh nhẹ nhàng nhanh chóng trộn đều trong vài giây. Sau đó dùng một phiến kính khác phiết thành tiêu bản.
Thao tác cần nhẹ nhàng, nhanh chóng để không làm tổn thương và chết các tinh trùng có khả năng tiến thẳng gây chết nhân tạo. tiêu bản càng mỏng càng tốt. đặt tiêu bản lên kính hiển vi có độ phóng đại 400-600 lần. đếm 500 hoặc 300 tinh trùng để phân loại tinh trùng sống, chết và tính theo công thức:
Sg %= D.100/500 (300) Trong đó: * Sg% là tỷ lệ tinh trùng sống. * D là tổng số tinh trùng sống đếm được. * 500 (300) là tổng số tinh trùng đếm. 3.5.6. Nồng độ tinh trùng (C) Phương pháp đánh giá
Có nhiều buồng đếm hồng cầu, bạch cầu như Toma, Goriacp, niubawơ. Nhưng về hình dạng cấu tạo của nó là tương tự như nhau và nguyên tắc sử dụng cũng như nhau. Buồng đếm hồng cầu được sử dụng để xác định số lượng các tế bào tinh trùng trong lần xuất tinh và được điều chỉnh theo kích thước để tất cả các tế bào tinh trùng được tính. Vì diện tích của mỗi ô bé nhất của buồng đếm là: S= 1/400 mm2 và độ sâu của buồng đếm là 1/10 mm. Chúng ta phải đếm số tinh
trùng quan sát được trong 5 ô trung bình (80 ô nhỏ). Đó cũng là số tinh trùng có được trong một thể tích 1/50 mm3. Từ đó có thể suy ra số lượng tinh trùng có trong 1m3 và trong 1cm3 (1ml) tinh dịch. Cách tiến hành như sau:
Đưa buồng đếm lên kính hiển vi có độ phóng đại từ 200- 600 lần, sau đó điều chỉnh kính hiển vi cho nhìn rõ buồng đếm. Đặt một lamen khô và sạch lên buồng đếm. Dùng ống pha loãng bạch cầu đã được rửa sạch sấy khô hút tinh dịch đến vạch 0,5 (hoặc vạch 1,0). Sau đó hút dung dịch nước muối NaCl 3%. Đến vạch 11 để giết tinh trùng và pha loãng tinh dịch. Trong quá trình hút tinh dịch hoặc hút nước muối cần chú ý không gây hiện tượng sủi bọt. Nếu có hiện tượng đó thì phải làm lại. Bịt 2 đầu của ống pha loãng bằng ngón tay cái và ngón tay nhẫn, lắc nhẹ 5 – 6 lần cho đều. Như vậy trong đoạn phình của ống pha loãng bạch cầu, tinh dịch được pha loãng 20 lần (nếu hút tinh dịch đến vạch 0,5) và 10 lần (nếu hút tinh dịch đến vạch 1,0). Bỏ đi đoạn nước muối 3% ở đoạn ống mao dẫn phía dưới của phần phình ra, vì ở phần này không có tinh trùng.
Sau nhỏ hỗn hợp này vào khe buồng đếm, chỉ cần đặt miệng của ống pha loãng vào mép lamen là do lực mao dẫn hỗn dịch sẽ được hút đầy vào buồng đếm (không làm hỗn hợp tràn lên mặt của lamen). Dùng ốc vi cấp chỉnh cho rõ buồng đếm và tinh trùng có trên đó. Nguyên tắc đếm tinh trùng giống như đếm hồng cầu, bạch cầu.
* Chú ý: khi đếm những tinh trùng nằm trên các cạnh mỗi ô chỉ đếm hai cạnh còn hai cạnh kia nhường cho ô khác.
Chúng ta đếm tinh trùng trong 5 ô trung bình (80 ô nhỏ) kết quả được bao nhiêu tinh trùng ta ghi nhận và tính theo công thức sau:
C = n. 400/N.p.106 (1)
Trong đó : - C : nồng độ tinh trùng có trong tinh dịch. - n : số tinh trùng đã đếm được trong 80 ô nhỏ.
- D : mức độ pha loãng (10 hoặc 20 lần). - P : độ sâu buồng đếm.
- N : số ô con đã đếm (80 ô).
Để đơn giản hóa cách tính toán, chúng ta phải pha loãng tinh dịch 20 lần trong ống hút bạch cầu. Số lượng tinh trùng đếm được trong 80 ô con là n. Như vậy số lượng tinh trùng đếm được trong 1ml tinh dịch sẽ là:
C = n. 50. 30. 103 = n. 106 Và công thức (1) sẽ là: C = n. 106
Như vậy 1 tinh trùng đếm được trên buồng đếm đại diện cho 1.000.000 tinh trùng [5].
Theo Nguyễn Tấn Anh (2003), nồng độ tinh trùng gà trung bình từ 3-5 tỷ/ml. Vì thế khi pha loãng tinh dịch ở nồng độ quá thấp (20-50 lần) thì khó có thể xác định được nồng độ tinh trùng gà bằng phương pháp đếm buồng đếm hồng cầu, bạch cầu [1].
Hình 3.2: Phương pháp đếm tinh trùng thông qua buồng đếm hồng cầu
Pha loãng tinh trùng (1000 lần) bằng phương pháp vi sinh vật
Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 9ml dung dịch NaCl 3% vô trùng, một số ống nghiệm chứa 0.9 ml dung dịch NaCl 3% vô trùng và một số pipet tự động (1ml) vô trùng. Pha loãng tinh dịch theo dãy thập phân [6].