Enzyme phản ứng với phần lớn các liên kết α (1,4) glucoside của các phân tử oligo và polysaccharide cho sản phẩm ban đầu là các oligosaccharide có cấu hình α. Tỉ lệ phân cắt ban đầu thì rất cao trên phân tử tinh bột ở hoà tan, có phần amylopectin và glycogen thấp hơn amylose. Sau đó sẽ giảm nhanh chóng với sự giảm chuỗi dài. những hạt tinh bột bắp thì nó tấn công một cách chậm chạp và những hạt tinh bột khoai tây thì không tiếp xúc hoàn toàn. Đặc điểm của enzyme này là cắt đứt liên kết α (1,4) tử đầu đến cuối phân tử cơ chất, phản ứng với iode cho màu xanh và độ nhớt của hỗn hợp phản ứng giảm nhanh chóng và đặc biệt là số liên kết bị cắt đứt, so với các enzyme ngoại bào, chẳng hạn như glucoamylase và β-amylase , khi thuỷ phân bằng enzyme B. amyloliquefaciens α-amylase thì phân tử lượng trung bình của cơ chất giảm nhanh hơn nhiều so với thuỷ phân bằng glucoamylase và β-amylase. Mặc dù liên kết α (1,6) ở những điểm nhánh không được phân cắt, α-amylase có thể bỏ qua chúng để tạo ra những đoạn mạch nhánh nhỏ hơn.
Có một vài sự tranh luận về mức độ mà B. amyloliquefaciens α-amylase tiến hành quá trình phân cắt phức tạp, nơi mà một trong hai sả phẩm không tách rời khỏi ezyme nhưng thay vì được phân cắt một cách được lập đi lập lại, thông thường nếu theo sự diễn ra như vậy thì sự xuất hiện của các chuỗi oligo-saccharide ngắn nhanh chóng hơn với hoạt động của enzyme nơi mà mỗi một sản phẩm được phóng thích sau mỗi đợt phân cắt bằng sự liên kết các chuỗi mới. Banks và Bendetskii đã tìm thấy sự phân cắt nhiều lần trên phân tử amylose. Tuy nhiên, Bendetskii và Yarovenko nói rằng α-amylase tiến hành phân cắt nhiều lần trên phân tử tinh bột, đặc biệt ở những nồng độ thấp. Phương pháp tính toán cũng ảnh hưởng đến báo cáo kết quả phạm vi phân cắt. Phương pháp của Thoma cho giá trị cao nhất, của Robyt và French cho giá trị trung bình còn của Banks và Greenwood cho giá trị thấp hơn.
amylase không hoàn toàn không có khả năng. Greenwood thấy rằng enzyme có thể biến đổi glucose hoặc maltose kể cả maltohexose hoặc amylose cho đến những sản phẩm lớn hơn những nguyên liệu ban đầu. Hehre cho rằng sự trùng hợp của α-D- glucopyranosylfluride cho ra các oligo-saccharide thông qua maltopentaose với sự phóng thích của F- , để thích hợp cho sự thuỷ phân của nó tạo ra glucose. Cuối cùng, Takashita và Hehre thấy rằng p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside và p-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside thể hiện như những chất nhận cho những sản phẩm từ amylose và glycogen, tạo ra các phân tử oligosaccharide có chiều dài khác nhau và một nữa phân tử glucose của chúng liên kết với nhau bằng liên kết α (1,4).
Điều được đề cập ở đây là α-amylase tấn công liên kết nhánh α (1,6) của cơ chất để tạo ra những đoạn phân tử vẫn còn chứa điểm nhánh. Khởi đầu là quan tâm đến những đoạn phân tử nhỏ nhất và tiếp tục thuỷ phân. Với B.amyloliquefaciens α- amylase, chỉ còn lại pentaose sau đó được nối dài bằng việc xử lý 62-α- maltosylmaltotriose.
Để làm sáng tỏ hơn cấu trúc phân tử của enzyme, điều cần thiết là biết phản ứng của nó nhanh như thế nào với polysaccharide và các chuỗi malto-oligosaccharide có chiều dài khác nhau và nơi trong chuỗi xuất hiện sự phân cắt. Bây giờ đã được biết đầy đủ, điều này đã được thiết lập tốt với dạng B. amyloliquefaciens.
Amylose và amylopectin cả hai đều cho sản phẩm ban đầu phần lớn là G2 , G3 , G6 và G7 với sự phân cắt dần theo thời gian và glucose được hình thành. Với glycogen, sản phẩm chính ban đầu là G6 và G7 , sau đó là G1 , G2 và G6 được tìm thấy với số lượng nhiều nhất. Với những cơ chất ngắn hơn, G6 được thuỷ phân chậm đến G1 và G5, với một vài G2 và G3 , G7 đi tới G1 và G6 và cũng từ G2 và G5, và G8 , G9 và G10 cho G2 , G3 và G6 . G12 sản xuất một loạt những sản ban đầu : G2 và G10 , G3 và G9 , G4 và G8 , và 2G6 . Sử dụng nhãn G6 để chỉ rằng sự phân cắt tại liên kết gần đoạn cuối.
Kết quả này là của chính 2 nhóm tác giả Thoma và Hiromi để thành lập sơ đồ cấu tạo phân tử của enzyme, mỗi nhóm sử dụng những kỹ thuật tính toán khác nhau dựa trên những dữ liệu thực nghiệm khác nhau, sự khác nhau này được giải thích bởi Thoma và Allen, nhưng tóm lại thì cũng rất giống nhau. Thoma và nhóm cộng sự sử
dụng α-metylmalto-oligosaccharide, thấy rằng Km giảm đều theo chuỗi dài 12, nhưng Vmax lại tăng ít nhất tới khi độ polymer hoá DP bằng 9. với sự phân cắt liên kết thường xuyên, điều này chỉ ra rằng trung tâm hoạt động có 9 cấu tử với vị trí xúc tác nằm ở giữa cấu tử thứ sáu và thứ bảy (chất nền nối lại trở thành chất có số lượng phân tử cao hơn bằng cách sử dụng phân tử glucose gần đoạn cuối). Lực liên kết thì âm ở mỗi phân tử, ngoại trừ tại cấu tử thứ 3 có giá trị dương thấp và giá trị dương cao tại cấu tử thứ 6 và 10. Năng lượng ở cấu tử thứ 3 để giành phân cắt, năng lượng ở cấu tử 6 và 10 để tăng thêm khả năng liên kết của oligosaccharide với đoạn cuối của trung tâm hoạt động để sự phân cắt ở gần vị trí cuối này. Mô hình này có thể dự đoán chính xác thời gian thuỷ phân tiến hành và tiến trình liên kết ưu tiên được bẻ gãy gần với đoạn cuối khi chuỗi dài giảm.
Nhóm của Hiromi xác định cấu hình phân tử bằng sự khác nhau của Vmax và Km với chất nền có chiều dài khác nhau bằng cách đầu tiên sử dụng liên kết phân cắt thường, như nhóm Thoma đã làm. Sau đó tìm thấy rằng giá trị Km giảm liên tục theo chuỗi dài, nhưng Vmax tăng cho đến khi cơ chất còn 8 đơn vị chiều dài. Tất cả các phân tử đều có năng lượng liên kết âm trừ phân tử thứ 6, với phân tử thứ 3 và thứ 7 thì ở gần 0. Vị trí phân cắt là giữa phân tử thứ 6 và thứ 7 và tổng số phân tử là 8. Nó dường như có một phân tử tryptofan và một phân tử tyrosine ở gần vị trí cắt và một phân tử histidine được đặt tại phân tử thứ nhất hoặc thứ ba, khi enzyme hoạt động cho G6 và lớn hơn nếu phân tử histidine này bị biến đổi bởi sự oxyhoá của ánh sáng. Lý thuyết về phân tử dễ dàng giải thích tại sao các enzyme thuỷ phân nội bào và ngoại bào sẽ tăng hoạt tính với sự tăng Vmax và sự giảm Km trên cơ chất có chuỗi dài tăng. Cơ chất mà không đủ dài để làm đầy các phân tử có năng lượng liên kết âm thì sẽ không thuận lợi, khi đó chúng không mạnh để chịu đựng sự phân cắt nhanh chóng. Khi cơ chất trở nên nhỏ hơn dần, lực liên kết ngày càng yếu dần và phản ứng ngày càng chậm hơn. Sự khác nhau về năng lượng liên kết từ phân tử đến phân tử có thể đáp ứng thay thế cho những cơ chất ngắn về vị trí phân cắt để sản phẩm đặc biệt được tạo ra. Trong trường hợp của B. amyloliquefaciens α-amylase, vị trí không đối xứng của điểm phân cắt quyết định G4 và G5 sẽ không được tạo thành với số lượng cao.
4.2.3. α-Amylase từ thermophilic bacilli
a. Giới thiệu
Trong những thập niên gần đây, α-amylase từ B. amyloliquefaciens đã được sử dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp, như sử dụng ở giai đoạn đầu sản xuất dextrin cung cấp cho việc sản xuất sirô có hàm lượng glucose cao. Một nghiên cứu mới để thay thế enzyme B. amyloliquefaciens bằng enzyme bền nhiệt hơn và có thể được sản xuất ở độ tập trung cao, cuối cùng enzyme α-amylase từ B. licheniformis được chấp nhận cho nhiều quá trình sản xuất. Trong phần này chúng ta thảo luận enzyme từ các loài Bacillus bền nhiệt và chịu nhiệt khác nhau, mà các đặc tính hoá lý của chúng đã được nghiên cứu.