c. B Licheniformis α-amylase
4.3.3.Động lực học và sự cân bằng trong phản ứng ngược
Phải nhất trí rằng glucoamylase tinh khiết, không có các enzyme khác, có thể thủy phân α(1,6) và α(1,3), cũng tốt như liên kết α(1,4), nhưng ngược lại, glucoamylase có thể tạo ra các nối này thì không được coi là tốt. Tuy nhiên, khái niệm về sự đảo chiều
cực nhỏ mới được chấp nhận gần đây và được xem như một sự cân bằng.
Có một vài dữ kiện về hiệu suất hình thành các nối này và các giá trị cân bằng của các kiểu kết quả, có được với các mẫu xem như đồng nhất tương đối, hay tại transferase-free tối thiểu, của glucoamylase.
Rhizopus niveus glucoamylase tại 55oC và khoảng chừng pH 5 tạo ra 96% glucose, 1.3% nigerose và maltose, 2.2% isomaltose, và 0.5% oligosaccharide, hầu hết isomaltose và panose trên nền tảng khô trong 96 giờ từ dung dịch ban đầu chứa khoảng 40% (w/v)glucose. Với Endomyces glucoamylase với cùng điều kiện, 3.1% isomaltose, 1.5% nigerose và maltose, 0.5% oligosaccharide, chủ yếu là isomaltotriose, panose, và maltotriose được hình thành. Một cách không rõ ràng là sự cân bằng có đạt được trong trường này hay không.
Hehre et al., dùng R.niveus glucoamylase thuần khiết tại 30oC và pH4.5, tìm thấy rằng chỉ β-glucose sẽ bắt đầu phản ứng đảo ngược, điều được mong đợi, khi nó là sản phẩm của phản ứng thủy phân được xúc tác bởi glucoamylase. Có sự tổng hợp maltose nhanh chóng nhưng bị giới hạn, sự hình thành của isomaltose thì chậm nhưng nhiều, và sự sản xuất nigerose và oligosaccharide trong 24 giờ thì chậm và bị giới hạn. Khi maltose là chất nền dưới cùng điều kiện trong một thí nghiệm 15 phút, maltotriose và panose, không có isomaltose được tìm thấy cùng với glucose. Một hằng số cân bằng cho maltose đã được xác định:
[maltose].[H2O] KMaltose =
Paxur et al., bằng A.niger glucoamylase được tinh sạch bằng DEAE-cellulose, nhưng không ghi rõ loại isoenzyme nào, nhận thấy rằng 30% (w/w) glucose tại pH3.5 và nhiệt độ phòng tạo ra hơn 1% sự đảo ngược thành mỗi nigerose và isomaltose sau 96 giờ, sản phẩm được hình thành rất nhanh. Không có sự hình thành maltose. Với khoảng 30% (w/v) maltose tại pH 4.8 và nhiệt độ phòng, 1.3% chất nền sẽ tạo thành isomaltose và 0.7% thành panose sau 24 giờ, một số lớn chuyển thành glucose. Trong trường hợp khác, đạt được sự cân bằng.
Roels and van Tilburg, sử dụng A.niger glucoamylase thương mại, nhiều free of transferase, nhưng hầu như chứa cả 2 loại isoenzyme, đo lường sự cân bằng và động lực học của sự đảo ngược glucose và của phản ứng thủy phân DE 15 dextrin tại pH4.5 với các nồng độ khác nhau (10-40%) và các nhiệt độ khác nhau (45-65oC). Sự cân bằng của maltose và isomaltose là không đáng kể với chất nền hay với nhiệt độ. Cần phải thừa nhận rằng tại các điều kiện này β-glucopyranose chiếm 63% tổng số glucose, đó là:
[maltose].[H2O] Kmaltose = = 0.45 [β-glucopyranose].[glucose] [isomaltose].[H2O] Kmaltose = = 2.6 [β-glucopyranose].[glucose]
Sự có mặt của nigerose và oligosaccharide không được ghi nhận.
Động lực học của sự hình thành maltose và isomaltose từ glucose được mô hình bằng việc dùng giới hạn thứ hai (second-order terms) và hằng số cân bằng vừa thu được và các dữ liệu thí nghiệm phù hợp có liên quan. Gia tăng nhiệt độ và nồng độ glucose làm tăng hiệu suất hình thành maltose và isomaltose, maltose được hình thành nhanh nhưng ở mức độ thấp hơn isomaltose.
Bài thuyết trình thứ hai từ cùng phòng thí nghiệm cho thấy nhiều mô hình hoàn chỉnh cho sự cân bằng giữa glucose và di-, oligosaccharide chứa liên kết α(1,4) và α(1,6) và từ các ghi nhận trước đó rằng enthalpy tự do của sự thủy phân maltose tại 60oC và đơn vị nồng độ của phản ứng là -3500 J/mol, nhưng đơn vị nồng độ của phản ứng của isomaltose là
1400 J/mol.
chuyển đổi là khi glucoamylase thủy phân dextrin.
Lee et al. sử dụng glucoamylase cố định và tan được để bẻ gãy các dextrin của các DE khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau. Với DE ban đầu thấp, sẽ đạt được DE cao tối đa do bởi giảm số lượng các sản phẩm phụ được hình thành khi tinh bột bị thủy phân các dextrin DE thấp. Các disaccharide bắt đầu gia tăng trước khi DE tối đa được đạt đến cùng lúc với sự tăng chậm các trisaccharide. Việc gia tăng nhiệt độ làm giảm nhẹ DE tối đa, nhưng nó làm tăng tốc độ thủy phân và sự tích lũy đột ngột các sản phẩm phụ.
Thật không dễ để nhất trí với các phát hiện khác nhau này. Roels và van Tilburg không tìm ra nigerose bằng các phương pháp mà họ sử dụng, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với cột Waters carbonhydrate không đủ khả năng để tách nigerose khỏi maltose. Họ đã tìm ra các oligosaccharide nhưng không báo cáo chúng. Sự vắng mặt của maltose trong báo cáo của Pazur et al. có thể bị tạo thành bởi pH thấp (pH3.5), so sánh với pH 4.5~5.0. Khi isomaltose được hình thành một cách chậm chạp từ glucose. Hehre et al. có thể tìm ra chúng trong thí nghiệm 15 phút mà sử dụng maltose như một cơ chất bởi vì không đủ thời gian để nó được hình thành.
Nếu hằng số cân bằng được báo cáo bởi Roels và van Tilburg là bất biến khi nhiệt độ hạ xuống 30oC được thực hiện bởi Hehre et al. một nồng độ maltose cho kết quả rằng là 3 lần lớn hơn đạt được với hằng số cân bằng gần đây nhất. Điều này cho thấy rằng tất cả maltose và nigerose bởi các vấn đề trước đã tạo ra các sai lầm đáng kể.
Dữ liệu cân bằng của Hehre et al. về sự hình thành của maltose và nước từ glucose và β-glucose dẫn tới một năng lượng tự do tiêu chuẩn 5000 J/mol. Điều này rất gần gũi với enthalpy chuẩn cho sự hình thành maltose và nước từ glucose (4585 J/mol tại 25oC và 4750 J/mol tại 35oC) và enthalpy chuẩn để hình thành 1 liên kết trung bình α(1,4) trong amylose (4300 J/mol).
Như đã đề cập trước đó, van Beynum et al năng lượng tự do tiêu chuẩn của thủy phân isomaltose thành glucose là 1400 J/mol. Isomaltose và nước từ β-glucose và glucose thì năng lượng tự do là -2650 J/mol. Đó là khoảng enthalpy chuẩn để hình
thành α(1,4) trong isomaltose (-5430 J/mol) hay hình thành liên kết này trong panose (-5180 J/mol) và giá trị gần tới zero bởi sự thiếu nhiệt độ phụ thuộc được tìm ra cho phản ứng bởi Roels va van Tilburg.
Như đã lưu ý, một trong các khó khăn trong nghiên cứu các phản ứng ngược là sự bất lực của các phương pháp sắc ký thông dụng để có thể phân tách disaccharide, maltose, nigerose; rõ ràng, vấn đề với trisaccharide và các phân tử lớn hơn là khó khăn. Sự khó khăn này là hiển nhiên đối với cả Watanabe et al. và Roels và van Tiburg, và cả Pazur et al. Sự tiến bộđgần đây nhất bở Nikolov và Reilly hứa hẹn cho phép có được độ chính xác cao trong việc đo lường maltose, nigerose, và isomaltose với các nồng độ khác nhau. Họ có thể phân tách hoàn toàn 6 loại anomeric của 3 disaccharide, sau trimethylsilylation, bằng sắc ký lỏng-khí (GLC) ở 240oC bởi cột mao quản silica SE-54.