nghệ thu (D. collettii) hái tại Sơn La
2.2.1.1. Chiết xuất
Xác định độ ẩm: Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy chạy tự động và hiển thị kết quả. Tiến hành 3 lần với 3 mẫu ở các 3 vị trí khác nhau để lấy trung bình.
Chiết xuất bằng cồn 80% ở nhiệt độ 700C: Dược liệu được nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp (bột thô) cho vào bình kín, chiết 3 lần với cồn 80% ở nhiệt độ 700C theo một tỷ lệ thích hợp, thu được dịch chiết toàn phần. Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn ethanol toàn phần.
Chiết phân bố tạo các dịch chiết phân đoạn: Phân tán cao cắn ethanol toàn phần trong nước, rồi tiến hành lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ n-hexan, ethylacetat, n-butanol. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm duy trì nhiệt độ nồi cách thủy dưới 600C, thu được lần lượt cao cắn phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol và nước tương ứng.
Hàm lượng cắn các phân đoạn được tính theo công thức:
F=
( ) x 100
Trong đó: F: hàm lượng chất (%) b: Khối lượng cắn (g)
M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g) x: độ ẩm dược liệu đem chiết (%)
21
2.2.1.2. Phân lập
Phân lập các hợp chất saponin trong thân rễ nần nghệ (D. collettii) bằng sắc ký cột. Trong đó chất hấp phụ (pha cố định) được nhồi trong cột hình trụ và dung môi pha động được khai triển liên tục với nhiều loại hệ dung môi khác nhau. Tùy theo chất được sử dụng trong cột khác nhau mà ta có các cơ chế và tên gọi khác nhau: Cột hấp phụ, cột phân bố, cột trao đổi ion…. Sắc ký cột được tiến hành trên cột silica gel pha thường (0,040- 0,063 mm và 0,020- 0,040 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Dianion HP- 20.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị:
+ Chất hấp phụ: Silica gel hấp phụ pha thuận và pha đảo.
+ Cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước dài 40cm, đường kính 2,9-3,2 cm. + Dung môi rửa giải là hỗn hợp dung môi được pha từ các dung môi thường dùng như: n-hexan, chloroform, ethylacetat, dicloromethan, aceton, methanol và nước.
Tiến hành phân lập:
+ Chuẩn bị cột: Cố định cột trên giá đỡ, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Cân một lượng silicagel vừa đủ, phân tán trong hệ dung môi rửa giải thành một hỗn hợp đồng nhất không có bọt khí. Mở khóa của cột, rót nhanh hỗn dịch silicagel vào cột để cho silicagel lắng tự nhên. Bổ sung silicagel liên tục lên cột, chú ý không để cột bị khô hay làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt. Sau khi silicagel chảy được 2 giờ thì bổ sung dung môi đến gần miệng cột. Đậy nút mài và để yên 12 giờ rồi tiến hành đưa mẫu lên cột.
+ Nạp mẫu lên cột: Hòa mẫu cần phân lập trong dung môi thích hợp, trộn đều với một lượng vừa đủ silicagel, sấy khô rồi tán thành bột tơi xốp. Cho bột lên
22
cột thật đều, rải thành một lớp mỏng đều đặn. Sau khi lớp bột mang mẫu ổn định, rắc thêm một lớp mỏng silica gel lên bề mặt và lót một lớp bông mỏng lên trên để tránh xáo động mặt cột khi cho dung môi rửa giải lên cột.
+ Rửa giải: Phản hấp phụ bằng một hệ dung môi thích hợp, kiểm soát tốc độ dòng chảy, hứng dịch rửa giải vào các bình nón hoặc ống nghiệm thích hợp. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có thành phần tương tự nhau thành những phân đoạn mới.
Tinh chế các chất phân lập:
Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan các chất phân lập.
Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lâp:
Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau.
2.2.1.3. Xác định cấu trúc hóa học của saponin phân lập được
Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-NMR và 2D-NMR) [7], [8] và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được với dữ liệu phổ có trong thư viện phổ và các tài liệu tham khảo.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của các carbon. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon. Nói cách khác các dữ liệu phổ cho biết carbon đó là C, CH, CH2, CH3, gián tiếp cho biết số carbon và hydro trong phân tử. Kỹ thuật thường được sử dụng hiện nay là DEPT. Trong phổ DEPT-135, C
23
bậc IV không xuất hiện, C bậc II là các đỉnh âm, C bậc I và III là các đỉnh dương. Ở phổ DEPT-90, chỉ có C bậc III là các đỉnh dương trong phổ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều còn cho thêm các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó (thường dùng hiện nay là HSQC), giữa proton của các C kế cận (phổ COSY), hay phổ tương tác giữa proton và các carbon kế cận (thường dùng phổ HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Brucker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội), tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.2. Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV 304 của saponin phân lập từ nần nghệ (D. collettii)