Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu EC

2.2.2.1. Thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV 304 của saponincó trong thân rễ nần nghệ (D. collettii)

Trước khi đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu (ECV304), tiến hành đánh giá nhằm thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV304 của saponin này.

Phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính trên tế bào là kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay) [42]

 Quy trình tiến hành

 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào: Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào ECV304 trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò, penicillin 100UI/ml: streptomycin 0,1mg/ml ở 370C trong môi trường không khí có 5% CO2. Nuôi tế bào đến khi tế bào phát triển ổn định. Cấy chuyển tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 2.103 tế bào/100 µl môi trường.

24

 Ủ tế bào vào mẫu thử: Hút loại bỏ môi trường cũ và thay bằng môi trường mới. Các giếng chứa tế bào được chia thành các lô và ủ với mẫu thử như sau:

Lô 1: Ủ với mẫu thử với nồng độ 400,00µg/ml Lô 2: Ủ với mẫu thử với nồng độ 200,00µg/ml Lô 3: Ủ với mẫu thử với nồng độ 100,00µg/ml

Lô chứng: Không ủ với mẫu thử, chỉ bổ sung DMSO

Tế bào được ủ với mẫu thử (hòa tan trong dimethyl sulfoxid- DMSO) với các nồng độ khác nhau (400,00, 200,00 và 100, 00µg/ml) trong 48 giờ, đảm bảo nồng độ DMSO trong mỗi giếng < 0,1%. Tiến hành song song với các giếng chứng (chỉ bổ sung dung môi pha mẫu thử là DMSO). Tế bào được chia thành các lô, mỗi lô 3 giếng:

 Đánh giá độc tính trên tế bào của mẫu thử

- Thêm 20µl thuốc thử MTT (nồng độ 5mg/ml) vào mỗi giếng.

- Ủ các đĩa 5h ở 370C trong môi trường không khí có 5% CO2, ủ trong bóng tối.

- Hút bỏ dung dịch ủ tế bào. Thêm 100µl dung dịch DMSO, trộn đều và để trong 15 phút. Đem đo quang ở bước sóng 540nm bằng máy ELISA.

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần ở cùng điều kiện.  Cách đánh giá kết quả

So sánh giá trị mật độ quang giữa các giếng có ủ với mẫu thử với các giếng không ủ với mẫu thử (giếng chứng) để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến chức năng sống của tế bào.

25

Mức độ gây chết tế bào của mẫu thử so với lô chứng được tính theo công thức:

X =100 ( ℎứ − ℎử)

ℎứ

Trong đó:

X: Phần trăm tế bào chết của lô thử so với lô chứng (%) OD chứng: Mật độ quang của giếng tế bào lô chứng OD thử: Mật độ quang của giếng tế bào lô thử

2.2.2.2. Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV304 của saponin có trong thân rễ nần nghệ (D. collettii)

Sau khi thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV 304 của các saponin có trong thân rễ nần nghệ (D. collettii). Tiến hành thử và đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu (ECV 304).

eNOS được hoạt hóa (gọi tắt là p-eNOS) khi phosphoryl hóa phân tử serin 1117 trên eNOS. Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS của hợp chất saponin tinh khiết trên dựa trên mức độ biểu hiện p-eNOS ở tế bào ECV 304 sau khi được ủ bằng kỹ thuật Western blot [24], [38], [41], [44]. Quy trình được thực hiện theo 4 bước:

 Nuôi cấy tế bào và ủ thuốc

- Tế bào ECV304 đang được bảo quản nhiệt độ ở - 800C, được hoạt hóa và nuôi cấy trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò (FBS), penicillin 100UI/ml, treptomycin 0,1mg/ml ở 370C trong môi trường không khí có 5%CO2. Cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng (mật độ 106 tế bào/2ml môi trường/giếng) và tiếp tục nuôi cấy trong 24h.

- Bổ sung mẫu thử đã được hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) với nồng độ 100mg/ml, 2µl/giếng (nồng độ cuối cùng của các mẫu thử trong các giếng tế bào là 100 µl/ml. Giếng chứng chỉ bổ sung 2µl DMSO/giếng.

26

Tế bào sau khi ủ với mẫu thử, hút loại bỏ hết môi trường nuôi cấy. Bổ sung dung dịch ly giải ECB (gồm Tris HCl 50mM, NaCl120mM, EDTA 1mM, NP-40 0,5%, NaF 50mM có bổ sung 1% phosphatase inhibitor và 1% protease inhibitor) để phá vỡ màng tế bào. Ly tâm loại bỏ cặn thu lấy protein sao cho nồng độ protein tổng số trong các mẫu đều là 2,5µl/1µl. Biến tính protein bằng dung dịch SDS 5x (gồm glycerol 50%, bromophenol 0,05%, sodium dodecyl sulfat 10%, mecarptoethanol 25%) ở 1000C trong 5 phút.

 Điện di trên gel polyacrylamid:

Hình 2.4. Quá trình chạy điện di

Tiến hành điện di protein trên polyacrylamid 8. Quá trình điện di gồm các bước sau:

Chuẩn bị và đồ bản gel polyacryamid 8% theo công thức sau: Bảng 2.1. Công thức chuẩn bị gel polyacrylamid

Hóa chất Phần gel phía dưới (lower gel)

Phần gel phía trên (upper gel) Bis- Acrylamid 40% 2000 µl 2000 µl Nước cất 3800 µl 5600 µl 1,5M Tris bazơ pH8,8 2000 µl 2500 µl SDS 10% 80 µl 200 µl Ammonium persulfat 10% 80 µl 50 µl N, N, N’, N’- tetramethylendiamin 8 µl 5 µl

27

Điện di protein trên bản gel polyacrylamid với dung dịch chạy điện di (running buffer: gồm glycerin 14,4g; tris bazơ 3,03g, SDS 1g, nước cất vừa đủ 1 lít), hiệu điện thế 150V trong 100 đến 120 phút (quan sát trên bán điện di thấy màu xanh của dung dịch tải mẫu di chuyển đến sát mép dưới bản gel thì dừng).

 Phát hiện protein

- Chuyển toàn bộ protein trên bản gel sang màng nitrocellulose bằng cách áp bản gel vào màng nitrocellulose lắp vào dụng cụ chuyển màng và đổ đầy dung dịch chạy chuyển màng (transfer buffer: gồm glycerin 14,4g, tris bazơ 3,03g, 200ml methanol, nước cất vừa đủ 1 lít), hiệu điện thế 60V trong 180 phút.

- Rửa màng nitrocellulose 3 lần bằng 10ml dung dịch TBT-T (25mM Tris buffered saline có bổ sung 0,05% tween 20), mỗi lần rửa trong 5 phút.

- Ủ màng với dung dịch sữa gầy 5% pha trong TBS-T 1 giờ ở nhiệt độ phòng, lắc đều liên tục trong quá trình ủ để phong bế các vị trí chưa liên kết với protein trên màng.

- Nhận biết eNOS đã hoạt hóa (p-eNOS) nằm trên màng nitrocellulose: ủ màng với kháng thể kháng p–eNOS (kháng thể thứ 1) qua đêm ở nhiệt độ 2- 80C, lắc liên tục trong quá trình ủ. Rửa sạch kháng thể 1 thừa bằng cách rửa màng 3 lần bằng dung dịch TBS-T, mỗi lần rửa trong 5 phút bằng 100ml dung dịch TBS-T. Ủ màng với kháng thể đơn dòng của thỏ (kháng thể thứ 2) có gắn sẵn horseradish peroxidase (HRP). Ủ màng với dung dịch luminal và dung dịch peroxide trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Khi có mặt hydro peroxide, HRP xúc tác cho phản ứng oxi hóa luminol tạo thành các chất phát quang. Ánh sáng quang học phát ra được hiện trên trên phim X- quang bằng cáp áp màng với phim X- quang trong bóng tối. Rửa phim để thu được bản film có chứa các tín hiệu protein.

28

- Sử dụng β-actin làm protein đối chứng. Nguyên tắc và cách tiến hành đánh giá biểu hiện của β-actin tương tự như trên trong đó sử dụng các kháng thể 1 là kháng thể kháng β-actin và kháng thể 2 là kháng thể đơn dòng của chuột nhắt có gắn HRP.

 Đánh giá kết quả

+ Dựa vào mật độ ánh sáng thu được tương ứng với các “dải protein” này trên phim X-quang.

+ So sánh mật độ ánh sángthu được từ các lô tế bào có ủ mẫu thử với các dải protein thu được từ lô chỉ ủ với dung môi dùng để pha mẫu thử để đánh giá ảnh hưởng của các mẫu thử trên mức độ biểu hiện các protein này. 2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft Excel 2007. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p<0,05. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M ± SD)

29

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học saponin có trong nần nghệ (D. collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La nần nghệ (D. collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La

3.1.1. Chiết xuất

Xác định độ ẩm dược liệu (x%):

Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C.

Thực hiện lặp lại 3 lần được kết quả độ ẩm dược liệu lần lượt là x1=8,1 %, x2= 8,1, x3=7,9%.

Vậy độ ẩm trung bình của dược liệu là x= (x1+x2+x3) : 3= 8,03%.

Chiết xuất:

Cân 1,0 kg bột thân rễnần nghệ (đã phơi sấy khô, xay nhỏ) (độ ẩm 8,03%) chiết với cồn 80%, tại nhiệt độ 70OC (3 lần x 4 giờ với các tỉ lệ dung môi/ dược liệu:10/1, 8/1 và 8/1). Gộp dung môi và loại dưới áp suất giảm thu được 187g cao tổng ký hiệu mẫu là NNEt80%. Hòa 187 gam cao tổng vào 1 lít nước, rồi siêu âm 20 phút cho cao tan hoàn toàn. Sau đó chiết phân lớp với n-hexan (3 lần x 1 lít) . Gộp dung môi phần phân lớp trên của phân đoạn rồi cô dưới áp suất giảm thu được 2,4g phân đoạn n-hexan ký hiệu mẫu là NNH. Phần nước sau khi chiết n-hexan tiếp tục được chiết phân lớp với ethyl acetat (3 lần x 1lít). Gộp dung môi phần phân lớp trên của phân đoạn và cô dưới áp suất giảm thu được 42,22 g cao phân đoạn ethyl acetat ký hiệu mẫu là NNEt. Phần nước (phần phía dưới của phân đoạn) sau khi chiết với ethyl acetat được tiếp tục chiết phân lớp với butanol (3 lần x 1 lít). Gộp dung môi phần phân lớp trên của phân đoạn và cô dưới áp suất giảm thu được 38,13g cao phân đoạn butanol ký hiệu mẫu là NNBu.

30

Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ nần nghệ STT Phân đoạn Khối lượng cắn

(gam)

% so với cắn toàn phần

% so với nguyên liệu thô

1 n-hexan 2,4 1,28 0,26

3 Ethylacetat 42,22 22,58 4,59

4 n-buthanol 38,13 20,39 4,14

Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và nguyên liệu thô được trình bày trong bảng 3.1.

Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân rễ nần nghệ (D. collettii)

Bột dược liệu (1,0kg) Cắn NNEt80% (187g) -EtOH Dịch nước 1 + Nước x1 lít + n-hexan, 3x1 lít

Dịch chiết n-hexan Dịch nước 2

Cắn NNH (2,4g)

Chiết với EtOH 80% (10/1; 8/1, 8/1)

- n-hexan

Dịch chiết EtOAc Dịch nước 3

+EtOAc, 3x 1 lít - n-Butanol Cắn NNEt (42,22g) Cắn nước -H2O Dịch nước 4 Dịch chiết n -Butanol Cắn NNBu (38,13g) - EtOAc +n-Butanol, 3x 1 lít

31

3.1.2. Phân lập

Phân lập từ cắn ethylacetat

Thu hồi dung môi Hòa tan cắn trong nước Chiết phân đoạn với n-hexan

Chiết phân đoạn với ethylacetat

Thu hồi dung môi

Cột silica gel pha thường DCM:MeOH:H2O

Cột silica gel pha đảo MeOH:H2O

Tinh chế Tinh chế

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất saponin từ thân rễ nần nghệ (D. collettii)

Phân đoạn n-hexan Phân đoạn nước

Phân đoạn ethylacetat Phân đoạn nước

Cắn ethylacetat (30,0g) (NNEt) P/đ NN1 P/đ NN2 P/đ NN3 P/đ NN4 P/đ NN5 P/đ NN6 (7,9g) P/đ NN7 P/đ NN6.1 P/đ NN6.2 P/đ NN6.3 (2,0g) P/đ NN6.4 (3,7g) Chất NN01 (139mg) Chất NN02 (123mg) Dược liệu 1,0kg cồn 800/700C (lần 1:10 lít , lần 2,3: 8 lít)

32

Bằng các phản ứng thử định tính, kết quả cho thấy phân đoạn cắn ethylacetat dương tính với thuốc thử của saponin, mặt khác phân đoạn này có hàm lượng cắn cao nhất. Do đó tiến hành phân lập saponin từ phân đoạn này. Cách tiến hành như sau:

Cắn ethylacetat (30,00g) được hòa tan với một lượng methanol tối thiểu, thêm lượng silicagel vừa đủ, trộn đều. Sau đó cất loại bỏ dung môi đến khi thu được bột khô tơi mịn. Bột này được đưa lên cột silicagel pha thường (cỡ hạt 0,040-0,063 mm) đã được chuẩn bị bằng phương pháp nhồi cột ướt, ổn định cột bằng hệ dung môi rửa giải.

Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi dicloromethane: methanol với độ phân cực tăng dần đến tỷ lệ DCM:MeOH:H2O (5:1:0,1, v/v). Hứng dịch rửa giải vào các bình tam giác và kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng. Những bình có thành phần như nhau trên sắc ký lớp mỏng được gom chung cất thu hồi dung môi thu được 7 phân đoạn ký hiệu: NN1NN7.

Trên sắc ký pha thường với hệ dung môi DCM:MeOH:H2O (5:1:0,1) thấy phân đoạn NN6 có số lượng vết ít nhất, trong đó có hai vết đậm lớn, dự kiến là vết saponin.

Triển khai sắc ký bản mỏng pha đảo phân đoạn NN6 với hệ dung môi MeOH:H2O (5:1) thấy 2 vết tách rõ. Do đó phân đoạn NN6 (7,3g) được hòa tan trong lượng tối thiểu MeOH và được đưa lên cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (5:1, v/v, 1lít). Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm. Kiểm tra dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng. Gom các ống nghiệm có thành phần như nhau trên sắc ký lớp mỏng. Thu được 4 phân đoạn NN6.1, NN6.2, NN6.3, NN6.4.

Phân đoạn NN6.3 (2.0g) phát hiện trên sắc ký lớp mỏng pha thường với hệ dung môi DCM:MeOH:H2O (5:1:0,1) và pha đảo với hệ dung môi

33

MeOH:H2O (5:1) vết duy nhất. Phân đoạn NN6.3 được kết tinh trong aceton lạnh qua đêm thu được hợp chất NN01 (139mg) dạng bột màu trắng.

Phân đoạn NN6.4 phát hiện trên sắc ký lớp mỏng pha thường với hệ dung môi DCM:MeOH:H2O (7:1:0,01) và pha đảo với hệ dung môi MeOH:H2O (3:1) vết duy nhất đậm, màu tím hồng.Phân đoạn NN6.4 được kết tinh trong aceton lạnh qua đêm thu được hợp chất NN02 (123mg) dạng bột màu trắng.

Hình 3.3. Cắn của các phân đoạn phân lập được

Hình 3.4. Chất NN01 Hình 3.5. Chất NN02

Sau khi phân lập chất được kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký bản mỏng pha thường silica gel 60F254 (105554.0001, HX271794, Merck) với hệ dung môi DMC/MeOH/H2O (5/1/0.01) và hệ dung môi dành cho các hợp chất steroid saponin là: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1) và Bản mỏng silica gel pha dảo (TLC RP-18 F254S, 1.05559.0001, HX267280) với hệ dung môi là

34

MeOH/H2O (5/1). Kết quả kiểm tra bản mỏng pha đảo và pha thường cho thấy NN01 và NN02 đều sạch.

Hình 3.6. Sắc ký đồ của NN01, T (cao ethanol 80%) và NN02 trên silica gel 60 RP-18 F254 (Merck, 5x10 cm), sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%

trong cồn tuyệt đối và hơ nóng

Hệ dung môi triển khai là: MeOH/H2O (8/1) Hình A: Sắc ký đồ chụp ở UV 365 nm. Hình B: Sắc ký đồ chụp dưới ánh sáng thường.

Hình 3.7. Sắc ký đồ NN01, T (cao ethanol 80%) và NN02 dưới ánh sáng thường, trên silica gel 60 F254 (Merck, 5x10 cm), sau khi phun thuốc thử

H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng Hệ dung môi triển khai là DCM/MeOH/H2O (3/1/0,1)

NN01 T NN02

NN01 T NN02 NN01 T NN02

35

3.1.3. Xác định cấu trúc 3.1.3.1. Chất NN01 3.1.3.1. Chất NN01

Hợp chất NN01: Bột vô định hình, không màu, nhiệt độ nóng chảy từ 2920C đến 2940C; Phổ HR – ESI – MS (m/z)= 885,4837 {M+H}+ và 877, 4556 {M+Na}+, Phổ 1H- NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC, COSY (bảng 3.2.)

Biện luận cấu trúc:

Chất NN01 thu được có dạng vô định hình, không màu. Phổ HR – ESI – MS có pic ion phân tử tại m/z 885,4837 {M+H}+ và 877,4556 {M+Na}+cho phép dự đoán công thức phân tử của NN01 là C45H72O17 (885).

Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất NN01

Hình 3.9. Phổ HSQC của hợp chất NN01 Trên phổ 1H của chất NN01 thấy tín hiệu của bốn nhóm metyl đặc trưng của khung steroid là: nhóm methyl liên kết với các bon bậc 4 cho tín hiệu proton single tại δH0.73 (s, H-18), 0.96 (s, H-19), 2 nhóm methyl liên kết với các bon bậc 3 cho tín hiệu douplet tại δH 0.90 (d, J = 6.5 Hz, H-21) và 0.73 (d,

J = 5.5 Hz, H-27), tín hiệu của một cặp olefin tại δH 5.33. Trên phổ 1H-NMR cũng cho tín hiệu douplet của nhóm methyl tại 1.08 (d, J = 6.0 Hz) gợi ý sự xuất hiện của 1 phân tử đường rhamnose trong cấu trúc phân tử. Trên phổ HSQC dễ dàng xác định vị trí của các nhóm methyl tại δ:16.0 (C-18), 18.9

Tín hiệu CH3

Nhóm

36

(C-19), 14.6 (C-21), 17.0 (C-27), cặp olefin tại δ: 140.3 (C-5), 121.3 (C-6) và nhóm methyl của đường Rhamnose tại δ:17.8. Mặt khác, trên phổ 13C có tín hiệu của carbon spirocetal tại δC 108.4 và tín hiệu của hai nhóm methin (CH) tại δ: 80.1 (C-16) và 61.8 (C-17) cho phép xác định phần aglycon của chất NN01 là diosgenin.

Trên phổ 13C-NMR cho tín hiệu của 45 carbon bao gồm có 27 carbon thuộc khung steroid và 18 carbon thuộc phần đường điều này gợi phần glycosid gồm 3 đường 6 carbon. Mặt khác có hai tín hiệu nhóm methylen tại

δ: 61 và 60.8 gợi ý xuất hiện của hai đường glucose và tín hiệu nhóm methyl tại δ: 17.8 (không thuộc khung aglycon) gợi ý sự xuất hiện của một phân tử đường rhamnose.

Phổ 1H-NMR cho biết sự xuất hiện của 3 proton anomeric tại δH 5.13 (H- 1Rha), 4.43 (d, J = 7.5 Hz, H-1GlcI), 4.279 (H-1GlcII). Hằng số tương tác của các proton anomeric là J=7.5 Hz và 6.0Hz, cho phép xác định liên kết cấu