ECV304 của saponin NN02 có trong nần nghệ (D. collettii)
Trước khi tiến hành đánh giá tác dụng của saponin có trong thân rễ nần nghệ (D. collettii) trên tế bào nội mô mạch máu ECV304, tiến hành thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của các saponin này. Đây là thử nghiệm nhằm khảo sát khả năng gây độc của mẫu thử trên dòng tế bào cụ thể sẽ sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo, đồng thời cũng là một trong những cơ sở để xem xét việc lựa chọn nồng độ mẫu thử khi đánh giá các tác dụng của mẫu này trên tế bào đó.
Phương pháp đánh giá khả năng gây độc tế bào được sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp MTT (MTT assay).
MTT assay là phương pháp thử độc tính của mẫu thử trên tế bào nuôi cấy thông qua xác định khả năng sống/chết của tế bào dựa vào chức năng của tế bào.
Trong ty thể của tế bào sống có chứa enzym succinat dehydrogenase hoạt động. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
54
(MTT) là chất hóa học có màu vàng, khi vào trong ty thể của tế bào sẽ bị dehydro bởi enzym succinat dehydrogenase tạo thành formazan là sản phẩm không tan, có màu tím đen. Các tế bào chết không có succinat dehydrogenase hoạt động, vì thế trong tế bào chết, không có sự tạo thành formazan.
Formazan không tan trong nước nhưng tan tốt trong ethanol, DMSO hoặc isopropanol. Có thể xác định sự sống/chết của tế bào thông qua sự có mặt của enzym succinat dehydrogenase bằng cách ủ tế bào với thuốc thử MTT, sau đó bổ sung dung môi hữu cơ (DMSO hoặc isopropanol) để hòa tan formazan rồi định lượng formazan bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 540nm.
Kết quả cho thấy saponin dioscin (NN02) ở các nồng độ 400µg/ml, 200µg/ml và 100µg/mlkhông gây độc tế bào. Do đó có thể lấy một trong ba nồng độ trên để tiếp tục thử tác dụng hoạt hóa eNOS. Ở đây chúng tôi chọn Dioscin (NN02) có nồng độ 100µg/ml để thử tác dụng.
Hoạt hóa eNOS làm tăng sản xuất NO [45], và NO đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị một số bệnh trong cơ thể như: xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính [15].
Osthol có rất nhiều hoạt tính sinh học như: chống ung thư, chống loạn nhịp tim, ngăn ngừa viêm gan và giãn mạch. Gần đây, osthol đã được chứng minh có tác dụng hạ huyết áp, làm giãn mạch [40]. Osthol tăng cường biểu hiện của eNOS và sự hoạt hóa protein này thông qua sự photphoryl hóa Ser- 1177, kích thích giải phóng NO trong lớp nội mô dẫn đến sự giãn mạch phổi [45]. Do đó, trong thử nghiệm tác dụng hoạt hóa eNOS chúng tôi đã lựa chọn osthol làm chứng dương.
Các nghiên cứu trên thế giới trước đó cho thấy cà ri (Fenugreek,
55
và làm tăng mức độ eNOS trong mạch vành, saffron và crocin có trong thành phần của nghệ tây (Crocus sativus, Iridaceae)cũng có tác dụng chống oxy hóa và eNOS [19]. Saponin ginsenoside có tác dụng kích hoạt eNOS và saponin trong nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng giải phóng NO từ các tế bào nội bào của thỏ [21]. Tuy nhiên ở Việt Nam, theo như chúng tôi được biết thì hầu như chưa có báo cáo nào về tác dụng hoạt hóa eNOS của hợp chất có trong dược liệu nói chung và saponin nói riêng. Việc nghiên cứu và phát hiện được saponin NN02 có tác dụng hoạt hóa eNOS là một một thành công to lớn của nhóm nghiên cứu, góp phần đưa thêm một bằng chứng tác dụng của dược liệu nần nghệ trong việc điều trị bệnh các bệnh liên quan đến việc giúp giải phóng NO như xơ vữa động mạch, rối loạn lipid máu, các bệnh tim mạch khác, bệnh tắc nghẽn phổi mãn tính. Hơn nữa từ việc phát hiện dioscin (NN02) được phân lập từ phân đoạn ethyl acetat tác dụng hoạt hóa eNOS giúp chúng ta có thể chứng minh hay làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn của hợp chất này để có thể dùng làm thuốc trên thử nghiệm lâm sàng. Tuy nhiên do thời gian còn nhiều hạn chế nên chúng tôi chỉ mới thử được một nồng độ dioscin (NN01) là 100 µg/ml, do đó chúng tôi đề xuất tiến hành thử tác dụng ở các nồng độ thấp hơn nhằm chứng minh rỏ ràng hơn về tác dụng hoạt hóa eNOS của dioscin (NN02).
56 KẾT LUẬN
Về chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của saponin trong nần nghệ
Đã chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc hóa học và tên 2 saponin có trong nần nghệ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La, Việt Nam là:
- Gracillin: Diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-{β-D- glucopyranosyl-(1→3)}-β-D-glucopyranoside) (NN01)
- Dioscin: Diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-{α-L- rhamnopyranosyl-(1→4)}-β-D-glucopyranoside(NN02)
Về đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV304 của dioscin (NN02) có trong nần nghệ
Saponin dioscin (NN02) với nồng độ 100µg/ml có tác dụng hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV304.
57 KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra một số đề xuất như sau: 1. Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của các phân đoạn khác của dược liệu.
2. Tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu các cơ chế khác có tác dụng chống xơ vữa động mạch của hợp chất nhằm làm sáng tỏ tác dụng của dược liệu này trong điều trị xơ vữa động mạch nói riêng và các bệnh tim mạch nói chung.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ Y tế, Giải phẩu sinh lý người, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam, tr. 119-121. 2. Hoàng Tiến Bành (1988), "Một số đặc điểm của dược liệu nần nghệ", Khóa luận
tốt nghiệp Dược sỹ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội., tr. 1-57 3. Bộ Khoa học và Công nghệ Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007),
Sách đỏ Việt Nam, Phần II: Thực vật, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ Hà Nội, tr. 391-392.
4. Bộ Khoa học và Công nghệ Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007),
Sách đỏ Việt Nam, Hà Nội, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ,
tr. 391-392.
5. Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), Thực vật học, Hà Nội, tr. 387-399
6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 328-340. 7. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa
học cây thuốc, NXB Y học, Hồ Chí Minh, tr. 243-283.
8. Nguyễn Hữu Đỉnh , Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp
phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr. 1-256.
9. Nguyễn Trí Dũng (2014), Mô học phân tử - Tập 2, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr. 17-300.
10. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, TP Hồ Chí Minh, quyển I, tr. 751.
11. Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích (1987), "Diosgenin trong một số loài Dioscorea ở Việt Nam", Công trình nghiên cứu khoa học Y Dược 1986, tr. 270-271
12. Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích, Đỗ Minh Hà (1983), "Diosgenin trong nần nghệ", Tạp chí dược học, 2, tr. 8-9.
13. Hoàng Kim Huyền, Nguyễn Minh Thu (1991), "Khảo sát độc tính của cao nần nghệ", Tạp chí dược học, tr. 28-29.
14. Hoàng Kim Huyền, Nguyễn Minh Thu, Nguyễn Hoàng, Nguyễn Trung Chính (1991), "Khảo sát sơ bộ một số tác dụng dược lý của nần nghệ", Tạp chí dược học, tr. 15-17.
15. Dương Qúy Sỹ, Lê Đông Nhật Nam, Hứa Huy Thông, Đinh Xuân Anh Tuấn (2011), "Rối loạn chức năng nội mô trong bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (BPTNMT): Vai trò của oxit nitơ và endothelin-1", J Fran Viet Pneu 02(05), tr. 1-92.
16. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu - tập 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 126-136.
17. Đỗ Thị Bích Thủy (1987), "Bước đầu nghiên cứu chế phẩm từ nần nghệ",
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 1-57.
18. Nguyễn Hoàng Tuấn (2016), "Đặc điểm thực vật cây nần nghệ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La", Tạp chí dược liệu, Tập 21, số 1+2, tr. 8-13.
Tiếng Anh
19. Ahmad R, Rahman T, Froemming GA, Nawawi H (2016), "Anti-oxidant properties of fenugreek and saponins, and their effects on eNOS expression on human coronary artery endothelial cells", Atherosclerosis, 252, p. 158. 20. Bonetti P. O. Lerman L.O., et al. (2003), Endothelial dysfunction: a marker
of atherosclerotic risk, Arterioscler Thromb Vasc Biol, pp. 168-175.
21. Chen Xiu, Lee Tony J‐F (1995), "Ginsenosides‐induced nitric oxide‐
mediated relaxation of the rabbit corpus cavernosum", British journal of
pharmacology, 115(1), pp. 15-18.
22. Cheryll Williams (2013), "Medicinal Plants in Australia ", An Antipodean Apothecary, 4, p. 437.
23. Dewick Paul M. (2009), "Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach", John Wiley and Sons Inc., USA, pp. 247-265.
24. Hong bao Ma. (2006), "Western Blotting method", The Journal of American Science, 2, pp. 23-27.
25. Howes L.G. Abbott D. et al (1997), "Lipoprotein and cardivascular reactivity", Br J Clin Pharmacol, 44, pp. 319-324.
26. Hu K and Yao X (2003), "The cytotoxicity of methyl protoneogracillin (NSC-698793) and gracillin (NSC-698787), two steroidal saponins from the rhizomes of Dioscorea collettii var. hypoglauca, against human cancer cells invitro", Phytotherapy Research, 17, pp. 620-626.
27. Hu K Dong A, Yao X, Kobayashi H, Iwasaki S (1996), "Antineoplastic agents; I. Three spirostanol glycosides from rhizomes of Dioscorea colletti
vatt. Hypoglauca.", Planta Medica, pp. 537-575.
28. Hu Ke, Dong Aijun, Yao Xinsheng, Kobayashi Hisayoshi, Iwasaki Shigeo (1997), "Antineoplastic agents II: four furostanol glycosides from rhizomes of Dioscorea collettii var. hypoglauca", Planta medica, 63(02), pp. 161-165. 29. Huang Yun Cui Lijian, Zhan Wenhong, Dou Yuhong, Wang Yongli, Wang
Qiang, and Zhao Ding (2007), "Separation and identification of steroidecompounds with cytotoxic activity againts human gastric cancer cell lines in vitro from the rhizomes of Pari polyphyllar var. chinensis ",
Chemistry of natural Compounds, 43(6), pp. 672-677.
30. Jayadev Raju Chinthalapally V. Rao2 " Diosgenin a Steroid Saponin Constituent of Yams and Fenugreek: Emerging Evidence for Applications in Medicine", Bioactive Compounds in Phytomedicine, p. 126.
31. Ke Hu Ai-Jun Dong Xin-Sheng Yao, Hisayoshi Kobayashi and Shigeo Iwasaki (1999), "Antineoplastic steroidal saponin from rhizomes of
Dioscorea colletti var. Hypoglauca", Advances in Plant Glycosides
Chemistry and Biology, 6, pp. 220-229.
32. Ke Hu Xinsheng Yao (2002), "The cytotoxicity of protoneodioscin (NSC- 698789), a furostanol saponin from the rhizomes of Dioscorea colletti var.
hypoglauca, against human cancer cells in vitro", Phytomedicine, pp. 550-565. 33. Li Huige Förstermann Ulrich (2000), "Nitric oxide in the pathogenesis of
34. Liu CL, Chen YY, Ge SB, Li BG (1983), "Studies on the constituents of Dioscorea plants. II. Isolation and identification of steroidal saponins from
Dioscorea collettii Hook. F", Yao xue xue bao= Acta pharmaceutica Sinica, 18(8), pp. 597-606.
35. Minghe Yang, Yanyong Chen (1983), "Steroidal sapogenins in Dioscorea collettii", Planta medica, 49(09), pp. 38-42.
36. Moncada S. HiggsA (1993), "The L- arginine-nitric oxide pathway", N Engl
J Med, 329, pp. 2002-2012.
37. Peter M.S.Palaniswami and K.V. (2008), "Horticulture Science Series",
Tuber and Root Crops, New India Publishing Agency, India, , 9, pp. 88-90.
38. RH.et.al Scofield (2006), "Western blotting", Methods, 38, pp. 283-293. 39. Sun Bu Tong, Zheng Li Hua, Bao Yong Li, Yu Chun Lei, Wu Yin, Meng
Xiang Ying, Li Yu Xin (2011), "Reversal effect of Dioscin on multidrug resistance in human hepatoma HepG2/adriamycin cells", European journal
of pharmacology, 654(2), pp. 129-134.
40. Teng Che-Ming, Lin Chein-Huang, Ko Feng-Nien, Wu Tian-Shung, Huang Tur-Fu (1994), "The relaxant action of osthole isolated from Angelica
pubescens in guinea-pig trachea", Naunyn-Schmiedeberg's archives of
pharmacology, 349(2), pp. 202-208.
41. Vogel H.G (2008), "Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays", Springer, p. 1455.
42. Weyermannet.al. (2005), "A practical note on the use of cytotoxicity assays",
International Journal of Pharmaceutics, 288, pp. 369-376.
43. Yang Deng-Jye, Lu Ting-Jang, Hwang Lucy Sun (2003), "Simultaneous determination of furostanol and spirostanol glycosides in Taiwanese yam (Dioscorea spp.) cultivars by high performance liquid chromatography",
Journal of Food and Drug Analysis, 11(4), pp. 271-276.
44. Yang Y., Hongbao Ma (2009), "Western Blotting and ELISA techniques",
45. Yao Li, Lu Ping, Li Yumei, Yang Lijing, Feng Hongxuan, Huang Yong, Zhang Dandan, Chen Jianguo, Zhu Daling (2013), "Osthole relaxes pulmonary arteries through endothelial phosphatidylinositol 3-kinase/Akt- eNOS-NO signaling pathway in rats", European journal of pharmacology, 699(1), pp. 23-32.
Tài liệu trực tuyến
46. http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-239984
PHỤ LỤC 1 PHỔ CỦA HỢP CHẤT NN01 - 1H- NMR - 13C-NMR - COSY - Dept - HMBC - HSQC
PHỤ LỤC 2 PHỔ CỦA HỢP CHẤT NN02 - 1H- NMR - 13C-NMR - COSY - Dept - HSQC - HMBC