Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV.
+ Silicagel dùng cho sắc ký cột pha thường (Merck, Kielselgel 60, cỡ hạt là 0,020- 0,040 và 0,040- 0,063mm), pha đảo (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd), Dianiom HP- 20.
+ Hóa chất: Acid sulfuric, acid clohydric, natri hydroxyd, natri carbonat…
+ Dung môi: Chloroform, methanol công nghiệp, methanol Merck, ethanol, aceton, nước cất, Acetonitril (Merck), acid phosphoric (Merck), nước cất 2 lần.
+ Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), huyết thanh ngựa (horse serum: HS), huyết thanh bò (fetal bovine serum: FBS) của hãng Invitrogen-Đức. Kháng thể kháng IgG thỏ có gắn HRP (anti-rabbit IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng IgG chuột nhắt có kháng HRP (anti-mouse IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng phospho-AMPKα-Thr172,kháng thể kháng β-actin (sc-47778) của hãng Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Califonia, USA).
19
+ Dụng cụ: bát sứ, ống nghiệm, pipet chính xác, bình nón, bình đựng mức, cốc có mỏ, ống đong, dụng cụ chứa tế bào (chai nuôi cấy, đĩa peptri,…), micropipet các loại
+ Thiết bị:
- Bếp cách thủy, sinh hàn hồi lưu, bình ngấm kiệt. - Máy HPLC Shimadzu LC- 10ATVP (Nhật Bản) - Cân phân tích Precisa(Thụy Sỹ)
- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức) - Máy đo độ ẩm Sartorius (Đức)
- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm
- Phổ khối ion hóa phun điện tử APCI-MS, HR - ESI-MS đo trên máy Agilent 1100LC –MSD Trap (Mỹ)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- NMR, 13C – NMR, HMBC, HSQC, COSY) đo trên máy Bruke AM500 FT- NMR (Thụy Sỹ) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy Volter
- Nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản) - Đĩa 96 giếng Costarb3596 (Corning, Mỹ)
- Máy đọc ELISA kèm theo bộ ủ ấm (xMark, Bio- Rad) - Thiết bị khuấy từ (Helidolph, Đức)
- Tủ hood hay tủ cấy tế bào (EUROCLONE Biological Safety Mỹ) - Tủ ấm CO2 (SANYO)
- Bể ổn nhiệt (MEMMERT) - Tủ mát, tủ lạnh (4 °C, -80 °C) - Dụng cụ đếm tế bào
- Kính hiển vi soi ngược (OLYMPUS CX41)
- Thiết bị chạy điện di và máy chuyển màng Bio-rad - Máy tính có cài đặt phần mềm Image J.
20 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Chiết xuất và phân lập, xác định cấu trúc saponin trong thân rễ nần nghệ thu (D. collettii) hái tại Sơn La nghệ thu (D. collettii) hái tại Sơn La
2.2.1.1. Chiết xuất
Xác định độ ẩm: Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C. Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy chạy tự động và hiển thị kết quả. Tiến hành 3 lần với 3 mẫu ở các 3 vị trí khác nhau để lấy trung bình.
Chiết xuất bằng cồn 80% ở nhiệt độ 700C: Dược liệu được nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp (bột thô) cho vào bình kín, chiết 3 lần với cồn 80% ở nhiệt độ 700C theo một tỷ lệ thích hợp, thu được dịch chiết toàn phần. Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn ethanol toàn phần.
Chiết phân bố tạo các dịch chiết phân đoạn: Phân tán cao cắn ethanol toàn phần trong nước, rồi tiến hành lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ n-hexan, ethylacetat, n-butanol. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm duy trì nhiệt độ nồi cách thủy dưới 600C, thu được lần lượt cao cắn phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol và nước tương ứng.
Hàm lượng cắn các phân đoạn được tính theo công thức:
F=
( ) x 100
Trong đó: F: hàm lượng chất (%) b: Khối lượng cắn (g)
M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g) x: độ ẩm dược liệu đem chiết (%)
21
2.2.1.2. Phân lập
Phân lập các hợp chất saponin trong thân rễ nần nghệ (D. collettii) bằng sắc ký cột. Trong đó chất hấp phụ (pha cố định) được nhồi trong cột hình trụ và dung môi pha động được khai triển liên tục với nhiều loại hệ dung môi khác nhau. Tùy theo chất được sử dụng trong cột khác nhau mà ta có các cơ chế và tên gọi khác nhau: Cột hấp phụ, cột phân bố, cột trao đổi ion…. Sắc ký cột được tiến hành trên cột silica gel pha thường (0,040- 0,063 mm và 0,020- 0,040 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Dianion HP- 20.
Các bước tiến hành:
Chuẩn bị:
+ Chất hấp phụ: Silica gel hấp phụ pha thuận và pha đảo.
+ Cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước dài 40cm, đường kính 2,9-3,2 cm. + Dung môi rửa giải là hỗn hợp dung môi được pha từ các dung môi thường dùng như: n-hexan, chloroform, ethylacetat, dicloromethan, aceton, methanol và nước.
Tiến hành phân lập:
+ Chuẩn bị cột: Cố định cột trên giá đỡ, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột. Cân một lượng silicagel vừa đủ, phân tán trong hệ dung môi rửa giải thành một hỗn hợp đồng nhất không có bọt khí. Mở khóa của cột, rót nhanh hỗn dịch silicagel vào cột để cho silicagel lắng tự nhên. Bổ sung silicagel liên tục lên cột, chú ý không để cột bị khô hay làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt. Sau khi silicagel chảy được 2 giờ thì bổ sung dung môi đến gần miệng cột. Đậy nút mài và để yên 12 giờ rồi tiến hành đưa mẫu lên cột.
+ Nạp mẫu lên cột: Hòa mẫu cần phân lập trong dung môi thích hợp, trộn đều với một lượng vừa đủ silicagel, sấy khô rồi tán thành bột tơi xốp. Cho bột lên
22
cột thật đều, rải thành một lớp mỏng đều đặn. Sau khi lớp bột mang mẫu ổn định, rắc thêm một lớp mỏng silica gel lên bề mặt và lót một lớp bông mỏng lên trên để tránh xáo động mặt cột khi cho dung môi rửa giải lên cột.
+ Rửa giải: Phản hấp phụ bằng một hệ dung môi thích hợp, kiểm soát tốc độ dòng chảy, hứng dịch rửa giải vào các bình nón hoặc ống nghiệm thích hợp. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có thành phần tương tự nhau thành những phân đoạn mới.
Tinh chế các chất phân lập:
Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan các chất phân lập.
Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lâp:
Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau.
2.2.1.3. Xác định cấu trúc hóa học của saponin phân lập được
Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-NMR và 2D-NMR) [7], [8] và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được với dữ liệu phổ có trong thư viện phổ và các tài liệu tham khảo.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của các carbon. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon. Nói cách khác các dữ liệu phổ cho biết carbon đó là C, CH, CH2, CH3, gián tiếp cho biết số carbon và hydro trong phân tử. Kỹ thuật thường được sử dụng hiện nay là DEPT. Trong phổ DEPT-135, C
23
bậc IV không xuất hiện, C bậc II là các đỉnh âm, C bậc I và III là các đỉnh dương. Ở phổ DEPT-90, chỉ có C bậc III là các đỉnh dương trong phổ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều còn cho thêm các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó (thường dùng hiện nay là HSQC), giữa proton của các C kế cận (phổ COSY), hay phổ tương tác giữa proton và các carbon kế cận (thường dùng phổ HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Brucker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội), tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.2. Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV 304 của saponin phân lập từ nần nghệ (D. collettii) ECV 304 của saponin phân lập từ nần nghệ (D. collettii)
2.2.2.1. Thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV 304 của saponincó trong thân rễ nần nghệ (D. collettii)
Trước khi đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu (ECV304), tiến hành đánh giá nhằm thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV304 của saponin này.
Phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính trên tế bào là kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay) [42]
Quy trình tiến hành
Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào: Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào ECV304 trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò, penicillin 100UI/ml: streptomycin 0,1mg/ml ở 370C trong môi trường không khí có 5% CO2. Nuôi tế bào đến khi tế bào phát triển ổn định. Cấy chuyển tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 2.103 tế bào/100 µl môi trường.
24
Ủ tế bào vào mẫu thử: Hút loại bỏ môi trường cũ và thay bằng môi trường mới. Các giếng chứa tế bào được chia thành các lô và ủ với mẫu thử như sau:
Lô 1: Ủ với mẫu thử với nồng độ 400,00µg/ml Lô 2: Ủ với mẫu thử với nồng độ 200,00µg/ml Lô 3: Ủ với mẫu thử với nồng độ 100,00µg/ml
Lô chứng: Không ủ với mẫu thử, chỉ bổ sung DMSO
Tế bào được ủ với mẫu thử (hòa tan trong dimethyl sulfoxid- DMSO) với các nồng độ khác nhau (400,00, 200,00 và 100, 00µg/ml) trong 48 giờ, đảm bảo nồng độ DMSO trong mỗi giếng < 0,1%. Tiến hành song song với các giếng chứng (chỉ bổ sung dung môi pha mẫu thử là DMSO). Tế bào được chia thành các lô, mỗi lô 3 giếng:
Đánh giá độc tính trên tế bào của mẫu thử
- Thêm 20µl thuốc thử MTT (nồng độ 5mg/ml) vào mỗi giếng.
- Ủ các đĩa 5h ở 370C trong môi trường không khí có 5% CO2, ủ trong bóng tối.
- Hút bỏ dung dịch ủ tế bào. Thêm 100µl dung dịch DMSO, trộn đều và để trong 15 phút. Đem đo quang ở bước sóng 540nm bằng máy ELISA.
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần ở cùng điều kiện. Cách đánh giá kết quả
So sánh giá trị mật độ quang giữa các giếng có ủ với mẫu thử với các giếng không ủ với mẫu thử (giếng chứng) để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến chức năng sống của tế bào.
25
Mức độ gây chết tế bào của mẫu thử so với lô chứng được tính theo công thức:
X =100 ( ℎứ − ℎử)
ℎứ
Trong đó:
X: Phần trăm tế bào chết của lô thử so với lô chứng (%) OD chứng: Mật độ quang của giếng tế bào lô chứng OD thử: Mật độ quang của giếng tế bào lô thử
2.2.2.2. Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV304 của saponin có trong thân rễ nần nghệ (D. collettii)
Sau khi thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV 304 của các saponin có trong thân rễ nần nghệ (D. collettii). Tiến hành thử và đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu (ECV 304).
eNOS được hoạt hóa (gọi tắt là p-eNOS) khi phosphoryl hóa phân tử serin 1117 trên eNOS. Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS của hợp chất saponin tinh khiết trên dựa trên mức độ biểu hiện p-eNOS ở tế bào ECV 304 sau khi được ủ bằng kỹ thuật Western blot [24], [38], [41], [44]. Quy trình được thực hiện theo 4 bước:
Nuôi cấy tế bào và ủ thuốc
- Tế bào ECV304 đang được bảo quản nhiệt độ ở - 800C, được hoạt hóa và nuôi cấy trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò (FBS), penicillin 100UI/ml, treptomycin 0,1mg/ml ở 370C trong môi trường không khí có 5%CO2. Cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng (mật độ 106 tế bào/2ml môi trường/giếng) và tiếp tục nuôi cấy trong 24h.
- Bổ sung mẫu thử đã được hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) với nồng độ 100mg/ml, 2µl/giếng (nồng độ cuối cùng của các mẫu thử trong các giếng tế bào là 100 µl/ml. Giếng chứng chỉ bổ sung 2µl DMSO/giếng.
26
Tế bào sau khi ủ với mẫu thử, hút loại bỏ hết môi trường nuôi cấy. Bổ sung dung dịch ly giải ECB (gồm Tris HCl 50mM, NaCl120mM, EDTA 1mM, NP-40 0,5%, NaF 50mM có bổ sung 1% phosphatase inhibitor và 1% protease inhibitor) để phá vỡ màng tế bào. Ly tâm loại bỏ cặn thu lấy protein sao cho nồng độ protein tổng số trong các mẫu đều là 2,5µl/1µl. Biến tính protein bằng dung dịch SDS 5x (gồm glycerol 50%, bromophenol 0,05%, sodium dodecyl sulfat 10%, mecarptoethanol 25%) ở 1000C trong 5 phút.
Điện di trên gel polyacrylamid:
Hình 2.4. Quá trình chạy điện di
Tiến hành điện di protein trên polyacrylamid 8. Quá trình điện di gồm các bước sau:
Chuẩn bị và đồ bản gel polyacryamid 8% theo công thức sau: Bảng 2.1. Công thức chuẩn bị gel polyacrylamid
Hóa chất Phần gel phía dưới (lower gel)
Phần gel phía trên (upper gel) Bis- Acrylamid 40% 2000 µl 2000 µl Nước cất 3800 µl 5600 µl 1,5M Tris bazơ pH8,8 2000 µl 2500 µl SDS 10% 80 µl 200 µl Ammonium persulfat 10% 80 µl 50 µl N, N, N’, N’- tetramethylendiamin 8 µl 5 µl
27
Điện di protein trên bản gel polyacrylamid với dung dịch chạy điện di (running buffer: gồm glycerin 14,4g; tris bazơ 3,03g, SDS 1g, nước cất vừa đủ 1 lít), hiệu điện thế 150V trong 100 đến 120 phút (quan sát trên bán điện di thấy màu xanh của dung dịch tải mẫu di chuyển đến sát mép dưới bản gel thì dừng).
Phát hiện protein
- Chuyển toàn bộ protein trên bản gel sang màng nitrocellulose bằng cách áp bản gel vào màng nitrocellulose lắp vào dụng cụ chuyển màng và đổ đầy dung dịch chạy chuyển màng (transfer buffer: gồm glycerin 14,4g, tris bazơ 3,03g, 200ml methanol, nước cất vừa đủ 1 lít), hiệu điện thế 60V trong 180 phút.
- Rửa màng nitrocellulose 3 lần bằng 10ml dung dịch TBT-T (25mM Tris buffered saline có bổ sung 0,05% tween 20), mỗi lần rửa trong 5 phút.
- Ủ màng với dung dịch sữa gầy 5% pha trong TBS-T 1 giờ ở nhiệt độ phòng, lắc đều liên tục trong quá trình ủ để phong bế các vị trí chưa liên kết với protein trên màng.
- Nhận biết eNOS đã hoạt hóa (p-eNOS) nằm trên màng nitrocellulose: ủ màng với kháng thể kháng p–eNOS (kháng thể thứ 1) qua đêm ở nhiệt độ 2- 80C, lắc liên tục trong quá trình ủ. Rửa sạch kháng thể 1 thừa bằng cách rửa màng 3 lần bằng dung dịch TBS-T, mỗi lần rửa trong 5 phút bằng 100ml dung dịch TBS-T. Ủ màng với kháng thể đơn dòng của thỏ (kháng thể thứ 2) có gắn sẵn horseradish peroxidase (HRP). Ủ màng với dung dịch luminal và dung dịch peroxide trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Khi có mặt hydro peroxide, HRP xúc tác cho phản ứng oxi hóa luminol tạo thành các chất phát quang. Ánh sáng quang học phát ra được hiện trên trên phim X- quang bằng cáp áp màng với phim X- quang trong bóng tối. Rửa phim để thu được bản film có chứa các tín hiệu protein.
28
- Sử dụng β-actin làm protein đối chứng. Nguyên tắc và cách tiến hành đánh giá biểu hiện của β-actin tương tự như trên trong đó sử dụng các kháng thể 1 là kháng thể kháng β-actin và kháng thể 2 là kháng thể đơn dòng của chuột nhắt có gắn HRP.
Đánh giá kết quả
+ Dựa vào mật độ ánh sáng thu được tương ứng với các “dải protein” này trên phim X-quang.
+ So sánh mật độ ánh sángthu được từ các lô tế bào có ủ mẫu thử với các dải protein thu được từ lô chỉ ủ với dung môi dùng để pha mẫu thử để đánh giá ảnh hưởng của các mẫu thử trên mức độ biểu hiện các protein này. 2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft Excel 2007. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p<0,05. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M ± SD)
29
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học saponin có trong nần nghệ (D. collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La nần nghệ (D. collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La
3.1.1. Chiết xuất