18
Bảng 2. 1. Hĩa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hĩa chất Nguồn gốc
1 1-octanol Wako, Nhật Bản
2 Acid propionic Merck, Đức
3 Agar Nhật Bản
5 Dầu Parafin Trung Quốc
6 Ether Trung Quốc
7 Nấm men Pháp
8 N-amyl acetat Wako, Nhật Bản
9 Natri benzoat Trung Quốc
10 Nước cất Việt Nam
11 Nước RO Việt Nam
12 Sữa bột nguyên kem Việt Nam
13 Sucrose Trung Quốc
⁕ Dụng cụ, thiết bị: Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê
trong bảng 2.2
Bảng 2. 2. Dụng cụ và thiết bị trong nghiên cứu
STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
1 Buồng tam giác và kính Việt Nam
2 Bút lơng để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung
Quốc
3 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ
4 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuơi ấu trùng
Việt Nam
5 Chày cối Việt Nam
6 Đĩa petri 90 mm, nắp đục lỗ Corning, Mỹ
7 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản
8 Kính hiển vi soi nổi Olympus, Nhật Bản
9 Lị vi sĩng Electrolux, Thụy Điển
19
11 Máy quay phim Canon, Nhật Bản
12 Micropipet Mettler Toledo, Mỹ
13 Miếng lĩt mềm Việt Nam
14 Ống chứa mùi Corning, Mỹ
15 Ống Eppendorf Đức
16 Hệ thống theo dõi nhịp sinh học trên ruồi giấm Trikinetic, Mỹ 17 Một số dụng cụ, thiết bị khác
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Quy trình chuẩn bị ruồi giấm phục vụ nghiên cứu
2.2.1.1. Nhân dịng ruồi giấm và chia lơ thí nghiệm
Nhân dịng ruồi giấm:
Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái (1:1) các cặp ruồi bố mẹ chủng Rugose để tạo dịng ruồi tự kỷ và chủng Canton-S để tạo dịng ruồi đối chứng sinh lý.
Mơi trường thức ăn cơ bản cho ruồi giấm bao gồm các thành phần sau: đường saccarose (5 % w/v), nấm men (5 % w/v), sữa bột (3 % w/v), agar (1 % w/v), acid propionic (0.5 % v/v), natri benzoat 10% (1 % v/v).
Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm. Ruồi giấm được nuơi trong phịng thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 1 oC, độ ẩm 50 %, chu kỳ 12 giờ sáng - 12 giờ tối (sáng từ 07 giờ đến 19 giờ). Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ).
Chia lơ thí nghiệm:
- Lơ sinh lý: ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuơi trong mơi trường thức ăn cơ bản.
- Lơ bệnh lý: ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuơi trong mơi trường thức ăn cơ bản.
- Lơ thử:
Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuơi trong mơi trường thức ăn cơ bản kết hợp BVNC nồng độ 2mg/ml.
20
Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuơi trong mơi trường thức ăn cơ bản kết hợp BVNC nồng độ 4mg/ml.
2.2.1.2. Quy trình chuẩn bị thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu
+ Đối với ấu trùng:
Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu. Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đĩ chuyển tồn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn. Để trứng phát triển thành ấu trùng và tiến hành thu ấu trùng giai đoạn ba (third – instar) phục vụ cho thí nghiệm.
+ Đối với ruồi trưởng thành:
Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu. Để ruồi đẻ trứng (2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đĩ chuyển tồn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn. Ấu trùng nở và đĩng kén trong 6-8 ngày, theo dõi ngày nở của kén, thu cá thể ruồi F1 mới nở, chuyển sang ống thức ăn cĩ mẫu nghiên cứu mới. Các cá thể ruồi F1 này phục vụ cho thí nghiệm ở các thời điểm thích hợp.
2.2.2. Thiết kế nghiên cứu
2.2.2.1. Thử nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng (social space assay)
Khả năng hình thành cộng đồng, tương tác xã hội là yếu tố quan trọng giúp sàng lọc cũng như đánh giá mức độ bệnh tự kỷ. Do đĩ, dựa trên mơ hình đánh giá được tiến hành theo mơ tả trước đây của tác giả Simon và cộng sự (2012) [58], chúng tơi tiến hành đánh giá tác dụng cải thiện khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm mang bệnh tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn BVNC.
Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi
Thử nghiệm hành vi
tương tác cộng đồng Thử nghiệm hành vi trí nhớ ngắn hạn Đánh giá hành vi vận động
Thử nghiệm đánh giá
21 Thử nghiệm được thiết kế như sau:
Buồng đánh giá cĩ dạng hình tam giác cân bằng nhựa (độ dài cạnh đáy và chiều cao tương ứng là 15,3cm) dày 0,5cm được đậy chặt bởi 2 tấm kính (kích thước 18cm x 18cm) cho phép ruồi hoạt động trong khơng gian hai chiều.
Hình 2. 1. Thiết kế thí nghiệm đánh giá tƣơng tác cộng đồng của ruồi giấm [62]
Hình ảnh thực tế buồng đánh giá hình tam giác (bên trái) và hình vẽ thể hiện kích thước của buồng (bên phải). Tương tác cộng đồng biểu thị thơng qua khoảng cách
ngắn nhất tới cá thể xung quanh.
Ruồi mới nở được phân đực, cái riêng và chuyển vào các ống chứa thức ăn chuẩn / mẫu nghiên cứu với số lượng ~ 40 con/ống và được nuơi trong 3-4 ngày. Ruồi được gây mê, sau đĩ cho vào buồng tam giác được đĩng lại bằng 2 phiến kính. Dựng đứng buồng và để yên trong 15 phút. Đập nhẹ buồng thí nghiệm xuống bàn 3 lần đảm bảo tồn bộ ruồi ở cùng một thời điểm xuất phát ở đáy buồng. Để yên cho ruồi tự do vận động, tương tác trong buồng trong 20 phút. Sau đĩ, chụp lại ảnh bằng máy ảnh và phân tích kết quả. Tiến hành lặp lại 8 lần với mỗi nhĩm.
22
2.2.2.2. Thử nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ của ấu trùng ruồi giấm (odor - taste learning)
Mơ hình đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm là một trong những thử nghiệm sử dụng để đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của Drosophila ASD [30], [36].
Thử nghiệm được thiết kế như sau:
1. Chuẩn bị mơi trường thạch:
- Đĩa petri X chứa 1,5 % thạch agar và đường sucrose 2M. - Đĩa petri Y chứa 1,5 % thạch agar và khơng cĩ đường.
2. Chuẩn bị mùi:
- Lấy 10 µl dung dịch mùi octanol cho vào ống đựng mùi. Đặt là mùi OCT.
- Pha lỗng dung dịch mùi n-amyl acetat với parafin (1:50), lấy 10µl dịch pha lỗng này cho vào các ống mùi cịn lại. Đặt là mùi AM.
- Đánh dấu các ống để phân biệt 2 mùi.
3. Chuẩn bị ấu trùng:
- Lựa chọn 24 ấu trùng 3-5 ngày tuổi cịn ở dưới thức ăn, rửa sạch thức ăn cịn bám trên ấu trùng.
4. Tiến hành tập luyện:
- Đặt ống đựng mùi AM (n-amyl acetat) lên đĩa X, đậy nắp để yên trong 1 phút. - Lấy những ấu trùng đã rửa sạch ở trên cho vào đĩa X, cho chúng làm quen với mùi AM và mơi trường đĩa X cĩ đường trong thạch trong 5 phút.
- Đến phút thứ 4 của quá trình trên, đặt ống đựng mùi OCT (mùi cịn lại) vào đĩa Y, đậy nắp để yên trong 1 phút.
- Sau khi hết 5 phút, chuyển các ấu trùng ở đĩa X sang đĩa Y, cho chúng làm quen với mùi OCT và đĩa Y khơng cĩ đường trong thạch trong 5 phút.
- Lặp lại quá trình trên 3 lần.
23
- Đến phút thứ 4 của bước tập luyện cuối cùng, tiến hành đặt ống mùi vào 3 đĩa test. Đặt mùi AM lên 1 bên trên đĩa test (đã kẻ sẵn vạch ở giữa), đặt mùi OCT lên bên cịn lại của đĩa test, đậy nắp và để yên trong 1 phút.
- Sau khi hết 5 phút của bước tập luyện cuối cùng, lần lượt chuyển 8 ấu trùng lên từng đĩa test và tiến hành kiểm tra trong 3 phút.
- Sau khi hết thời gian kiểm tra, đếm số ấu trùng ở 2 bên, phía mùi AM và OCT, ghi nhận kết quả.
- Quá trình được tiến hành nhiều lần, để hạn chế sai số tiến hành kết hợp mùi AM với đĩa X, mùi OCT với đĩa Y; lần kế tiếp làm ngược lại với mùi OCT đĩa X và mùi AM đĩa Y.
- Các ấu trùng khi cho vào đĩa thạch, được đặt vào khoảng chính giữa đĩa thạch đã kẻ từ trước.
Hình 2. 2. Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm [30]
Kết quả được tính theo chỉ số PREFAM, PREFOCT và LI
24 Trong đĩ:
- PREFAM là chỉ số ưu tiên mùi AM, được tính ở những thí nghiệm mà mùi AM được kết hợp với phần thưởng để đo tỷ lệ ấu trùng nhớ mùi và đi về phía mùi AM.
- PREFOCT là chỉ số ưu tiên mùi OCT, được tính ở những thí nghiệm mà mùi OCT được kết hợp với phần thưởng để đo tỷ lệ nhớ mùi và đi về phía mùi OCT. - LI là chỉ số học tập (Learning Index).
+ LI > 0 cho thấy ấu trùng cĩ khả năng học tập hay ghi nhớ. + LI ~0 cho thấy ấu trùng khơng cĩ khả năng học tập hay ghi nhớ. +LI < 0 cho thấy mùi gây khĩ chịu cho ruồi giấm.
2.2.2.3. Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển (bị) của ấu trùng ruồi giấm (crawling assay)
Dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự năm 2012 [47], chúng tơi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm với mục tiêu đánh giá sự cải thiện khả năng vận động của cao chiết BVNC.
Thử nghiệm được tiến hành như sau: 1. Chuẩn bị đĩa
- Chuẩn bị đĩa petri đường kính 10-12cm, làm sạch.
- Đổ thạch Agar 1,2 % lên đĩa, bề mặt láng đều, để ráo nước trước khi thí nghiệm.
2. Chuẩn bị ấu trùng
- Thu ấu trùng bậc 3 (khoảng 5 ngày tuổi), nằm bên trong mơi trường thức ăn, cách bề mặt mơi trường khoảng 1-2cm, các ấu trùng đang bị ổn định, kích thước lớn đều nhau. Soi bộ phận sinh dục của ấu trùng dưới kính hiển vi để lựa chọn ấu trùng đực.
- Lưu ý: Khơng thu ấu trùng yếu do mật độ ấu trùng quá đơng, mơi trường quá cứng khơng phù hợp cho phát triển, tránh tổn thương đến ấu trùng trong quá trình bắt.
3. Tiến hành thí nghiệm
25
- Chuẩn bị máy quay, đặt song song camera với bề mặt đĩa, tránh rung lắc trong suốt quá trình quay.
- Chuẩn bị thước scale, giấy tối màu, ít phản quang, đặt bên dưới đĩa agar. - Chuyển ấu trùng lên đĩa agar, 4-6 cá thể ấu trùng/lần quay, quay với khung hình đề nghị 640*480, 30 frames/s.
- Tiến hành ghi lại video trong 1 phút và phân tích kết quả. - Tiêu chí đánh giá: Tốc độ di chuyển của ấu trùng (cm/s).
Hình 2. 3. Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng bị của ấu trùng ruồi giấm
2.2.2.4. Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (activity assay)
Rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học là những biểu hiện thường thấy ở trẻ mắc rối loạn phổ tự kỷ. Chúng tơi tiến hành thí nghiệm dựa trên mơ tả trong nghiên cứu của Wise và cộng sự (2015) [66] để đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trên các nhĩm khác nhau.
Thử nghiệm được tiến hành như sau: 1. Chuẩn bị ruồi
- Ruồi đực trưởng thành 1-2 ngày tuổi. Số lượng ruồi trong một lần thí nghiệm: 4 lơ ruồi giấm, mỗi lơ 8 con.
2. Chuẩn bị thức ăn
- Nấu thức ăn trắng và thức ăn chứa mẫu dược liệu sau đĩ cho thức ăn vào ống theo dõi đường kính 5mm, chiều dài 8cm (lượng thức ăn cao khoảng 0,5cm).
3. Tiến hành thí nghiệm
- Gây mê ruồi bằng ether, chia vào các ống theo dõi, mỗi ống một con ruồi đực trưởng thành, gồm các lơ: lơ đối chứng (Canton-S), lơ ruồi mang bệnh tự kỷ (Rugose) và lơ ruồi mang bệnh tự kỷ được điều trị với cao BVNC ở 2 liều tương ứng 2mg/ml và 4mg/ml. Cho mỗi con vào 1 ống theo dõi tương ứng với từng lơ.
26
- Đặt ống theo dõi vào máy theo dõi hoạt động thức - ngủ của ruồi Trikinetics. - Theo dõi liên tục trong vịng 7-10 ngày, chu kì sáng/tối 12 giờ/12 giờ ở điều kiện 25 oC. Số lần ruồi di chuyển qua một chùm tia hồng ngoại cắt ngang vuơng gĩc ở giữa ống theo dõi được ghi lại 30 phút/lần.
Hình 2. 4. Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor
(Nguồn: Khoa Dược lý - Sinh hĩa, Viện Dược liệu)
2.2.3. Phân tích kết quả
Kết quả của thí nghiệm tương tác cộng đồng của ruồi giấm, thí nghiệm đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm được xử lý bằng phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ sau đĩ phân tích thống kê bằng phần mềm SPSSv20. Kết quả của thí nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm và thí nghiệm nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành được tổng hợp bằng Microsoft Excel và phân tích bằng SPSSv20. Với số liệu thuộc phân phối chuẩn, kết quả biểu diễn bởi giá trị trung bình và sai số chuẩn. So sánh kết quả giữa các lơ bằng kiểm định One – way ANOVA. Với số liệu khơng thuộc phân phối chuẩn, kết quả biểu diễn bởi giá trị trung vị và các
27
tứ phân vị. So sánh kết quả giữa các lơ bằng kiểm định Kruskal Wallis. Sự khác biệt giữa các lơ được coi là cĩ ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tƣơng tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ
Sự suy giảm khả năng hoạt động cộng đồng, tương tác xã hội là yếu tố đặc trưng để nhận biết bệnh lý tự kỷ. Do vậy, kết quả mơ hình tương tác cộng đồng là tiêu chí quan trọng để đánh giá tác dụng của thuốc điều trị tự kỷ. Thử nghiệm được tiến hành trên ruồi giấm trưởng thành giai đoạn 3 ngày tuổi và thực hiện song song trên các lơ ruồi khác nhau. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.1.
(A)
Canton-S Rugose
28 (B) Canton S 0 2 4 0 1 2 3 4 K hoản g c ách tớ i con gầ n n hất (c m ) BVNC (mg/ml) Rugose *** ** ***
Hình 3. 1. Thử nghiệm hành vi tƣơng tác cộng đồng trên ruồi giấm trƣởng thành
A) Hình ảnh phân bố của quần thể ruồi trong khơng gian. B) Kết quả phân tích
khoảng cách tương tác khơng gian của ruồi giấm ở các lơ khác nhau. N=600-650 cá thể/lơ.
** p < 0,01; *** p < 0,001 so sánh với lơ chứng bệnh lý (Rugose). Chú thích:
Canton-S (lơ chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.
Rugose (lơ chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ.
BVNC 2, BVNC 4 (lơ thử): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ, được
điều trị bằng cao BVNC ở các nồng độ tương ứng 2mg/ml và 4mg/ml.
Kết quả Hình 3.1 cho thấy khoảng cách gần nhất giữa hai cá thể ruồi giấm đột biến gen rugose (Rugose) lớn hơn so với ruồi giấm chủng hoang dại (Canton-S), sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,001. Ở hình A, các cá thể ở nhĩm Rugose đứng riêng lẻ và rải rác trong khơng gian, ít di chuyển thành từng đám giống như ở nhĩm chứng sinh lý (Canton-S). Các lơ ruồi đột biến gen rugose sau khi điều trị bằng cao BVNC ở các nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml cho thấy khoảng cách gần nhất giữa hai
29
cá thể giảm đáng kể so với lơ chứng bệnh lý, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa thống kê tương ứng với p < 0,01 và p < 0,001.
3.2. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ
Thử nghiệm học tập của ấu trùng dựa trên mùi vị thường được sử dụng để đánh giá khả năng ghi nhớ của ruồi giấm tự kỷ. Thí nghiệm được tiến hành qua hai giai