2.2.2.1. Thử nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng (social space assay)
Khả năng hình thành cộng đồng, tương tác xã hội là yếu tố quan trọng giúp sàng lọc cũng như đánh giá mức độ bệnh tự kỷ. Do đĩ, dựa trên mơ hình đánh giá được tiến hành theo mơ tả trước đây của tác giả Simon và cộng sự (2012) [58], chúng tơi tiến hành đánh giá tác dụng cải thiện khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm mang bệnh tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn BVNC.
Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi
Thử nghiệm hành vi
tương tác cộng đồng Thử nghiệm hành vi trí nhớ ngắn hạn Đánh giá hành vi vận động
Thử nghiệm đánh giá
21 Thử nghiệm được thiết kế như sau:
Buồng đánh giá cĩ dạng hình tam giác cân bằng nhựa (độ dài cạnh đáy và chiều cao tương ứng là 15,3cm) dày 0,5cm được đậy chặt bởi 2 tấm kính (kích thước 18cm x 18cm) cho phép ruồi hoạt động trong khơng gian hai chiều.
Hình 2. 1. Thiết kế thí nghiệm đánh giá tƣơng tác cộng đồng của ruồi giấm [62]
Hình ảnh thực tế buồng đánh giá hình tam giác (bên trái) và hình vẽ thể hiện kích thước của buồng (bên phải). Tương tác cộng đồng biểu thị thơng qua khoảng cách
ngắn nhất tới cá thể xung quanh.
Ruồi mới nở được phân đực, cái riêng và chuyển vào các ống chứa thức ăn chuẩn / mẫu nghiên cứu với số lượng ~ 40 con/ống và được nuơi trong 3-4 ngày. Ruồi được gây mê, sau đĩ cho vào buồng tam giác được đĩng lại bằng 2 phiến kính. Dựng đứng buồng và để yên trong 15 phút. Đập nhẹ buồng thí nghiệm xuống bàn 3 lần đảm bảo tồn bộ ruồi ở cùng một thời điểm xuất phát ở đáy buồng. Để yên cho ruồi tự do vận động, tương tác trong buồng trong 20 phút. Sau đĩ, chụp lại ảnh bằng máy ảnh và phân tích kết quả. Tiến hành lặp lại 8 lần với mỗi nhĩm.
22
2.2.2.2. Thử nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ của ấu trùng ruồi giấm (odor - taste learning)
Mơ hình đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm là một trong những thử nghiệm sử dụng để đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của Drosophila ASD [30], [36].
Thử nghiệm được thiết kế như sau:
1. Chuẩn bị mơi trường thạch:
- Đĩa petri X chứa 1,5 % thạch agar và đường sucrose 2M. - Đĩa petri Y chứa 1,5 % thạch agar và khơng cĩ đường.
2. Chuẩn bị mùi:
- Lấy 10 µl dung dịch mùi octanol cho vào ống đựng mùi. Đặt là mùi OCT.
- Pha lỗng dung dịch mùi n-amyl acetat với parafin (1:50), lấy 10µl dịch pha lỗng này cho vào các ống mùi cịn lại. Đặt là mùi AM.
- Đánh dấu các ống để phân biệt 2 mùi.
3. Chuẩn bị ấu trùng:
- Lựa chọn 24 ấu trùng 3-5 ngày tuổi cịn ở dưới thức ăn, rửa sạch thức ăn cịn bám trên ấu trùng.
4. Tiến hành tập luyện:
- Đặt ống đựng mùi AM (n-amyl acetat) lên đĩa X, đậy nắp để yên trong 1 phút. - Lấy những ấu trùng đã rửa sạch ở trên cho vào đĩa X, cho chúng làm quen với mùi AM và mơi trường đĩa X cĩ đường trong thạch trong 5 phút.
- Đến phút thứ 4 của quá trình trên, đặt ống đựng mùi OCT (mùi cịn lại) vào đĩa Y, đậy nắp để yên trong 1 phút.
- Sau khi hết 5 phút, chuyển các ấu trùng ở đĩa X sang đĩa Y, cho chúng làm quen với mùi OCT và đĩa Y khơng cĩ đường trong thạch trong 5 phút.
- Lặp lại quá trình trên 3 lần.
23
- Đến phút thứ 4 của bước tập luyện cuối cùng, tiến hành đặt ống mùi vào 3 đĩa test. Đặt mùi AM lên 1 bên trên đĩa test (đã kẻ sẵn vạch ở giữa), đặt mùi OCT lên bên cịn lại của đĩa test, đậy nắp và để yên trong 1 phút.
- Sau khi hết 5 phút của bước tập luyện cuối cùng, lần lượt chuyển 8 ấu trùng lên từng đĩa test và tiến hành kiểm tra trong 3 phút.
- Sau khi hết thời gian kiểm tra, đếm số ấu trùng ở 2 bên, phía mùi AM và OCT, ghi nhận kết quả.
- Quá trình được tiến hành nhiều lần, để hạn chế sai số tiến hành kết hợp mùi AM với đĩa X, mùi OCT với đĩa Y; lần kế tiếp làm ngược lại với mùi OCT đĩa X và mùi AM đĩa Y.
- Các ấu trùng khi cho vào đĩa thạch, được đặt vào khoảng chính giữa đĩa thạch đã kẻ từ trước.
Hình 2. 2. Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm [30]
Kết quả được tính theo chỉ số PREFAM, PREFOCT và LI
24 Trong đĩ:
- PREFAM là chỉ số ưu tiên mùi AM, được tính ở những thí nghiệm mà mùi AM được kết hợp với phần thưởng để đo tỷ lệ ấu trùng nhớ mùi và đi về phía mùi AM.
- PREFOCT là chỉ số ưu tiên mùi OCT, được tính ở những thí nghiệm mà mùi OCT được kết hợp với phần thưởng để đo tỷ lệ nhớ mùi và đi về phía mùi OCT. - LI là chỉ số học tập (Learning Index).
+ LI > 0 cho thấy ấu trùng cĩ khả năng học tập hay ghi nhớ. + LI ~0 cho thấy ấu trùng khơng cĩ khả năng học tập hay ghi nhớ. +LI < 0 cho thấy mùi gây khĩ chịu cho ruồi giấm.
2.2.2.3. Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển (bị) của ấu trùng ruồi giấm (crawling assay)
Dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự năm 2012 [47], chúng tơi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm với mục tiêu đánh giá sự cải thiện khả năng vận động của cao chiết BVNC.
Thử nghiệm được tiến hành như sau: 1. Chuẩn bị đĩa
- Chuẩn bị đĩa petri đường kính 10-12cm, làm sạch.
- Đổ thạch Agar 1,2 % lên đĩa, bề mặt láng đều, để ráo nước trước khi thí nghiệm.
2. Chuẩn bị ấu trùng
- Thu ấu trùng bậc 3 (khoảng 5 ngày tuổi), nằm bên trong mơi trường thức ăn, cách bề mặt mơi trường khoảng 1-2cm, các ấu trùng đang bị ổn định, kích thước lớn đều nhau. Soi bộ phận sinh dục của ấu trùng dưới kính hiển vi để lựa chọn ấu trùng đực.
- Lưu ý: Khơng thu ấu trùng yếu do mật độ ấu trùng quá đơng, mơi trường quá cứng khơng phù hợp cho phát triển, tránh tổn thương đến ấu trùng trong quá trình bắt.
3. Tiến hành thí nghiệm
25
- Chuẩn bị máy quay, đặt song song camera với bề mặt đĩa, tránh rung lắc trong suốt quá trình quay.
- Chuẩn bị thước scale, giấy tối màu, ít phản quang, đặt bên dưới đĩa agar. - Chuyển ấu trùng lên đĩa agar, 4-6 cá thể ấu trùng/lần quay, quay với khung hình đề nghị 640*480, 30 frames/s.
- Tiến hành ghi lại video trong 1 phút và phân tích kết quả. - Tiêu chí đánh giá: Tốc độ di chuyển của ấu trùng (cm/s).
Hình 2. 3. Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng bị của ấu trùng ruồi giấm
2.2.2.4. Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (activity assay)
Rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học là những biểu hiện thường thấy ở trẻ mắc rối loạn phổ tự kỷ. Chúng tơi tiến hành thí nghiệm dựa trên mơ tả trong nghiên cứu của Wise và cộng sự (2015) [66] để đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trên các nhĩm khác nhau.
Thử nghiệm được tiến hành như sau: 1. Chuẩn bị ruồi
- Ruồi đực trưởng thành 1-2 ngày tuổi. Số lượng ruồi trong một lần thí nghiệm: 4 lơ ruồi giấm, mỗi lơ 8 con.
2. Chuẩn bị thức ăn
- Nấu thức ăn trắng và thức ăn chứa mẫu dược liệu sau đĩ cho thức ăn vào ống theo dõi đường kính 5mm, chiều dài 8cm (lượng thức ăn cao khoảng 0,5cm).
3. Tiến hành thí nghiệm
- Gây mê ruồi bằng ether, chia vào các ống theo dõi, mỗi ống một con ruồi đực trưởng thành, gồm các lơ: lơ đối chứng (Canton-S), lơ ruồi mang bệnh tự kỷ (Rugose) và lơ ruồi mang bệnh tự kỷ được điều trị với cao BVNC ở 2 liều tương ứng 2mg/ml và 4mg/ml. Cho mỗi con vào 1 ống theo dõi tương ứng với từng lơ.
26
- Đặt ống theo dõi vào máy theo dõi hoạt động thức - ngủ của ruồi Trikinetics. - Theo dõi liên tục trong vịng 7-10 ngày, chu kì sáng/tối 12 giờ/12 giờ ở điều kiện 25 oC. Số lần ruồi di chuyển qua một chùm tia hồng ngoại cắt ngang vuơng gĩc ở giữa ống theo dõi được ghi lại 30 phút/lần.
Hình 2. 4. Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor
(Nguồn: Khoa Dược lý - Sinh hĩa, Viện Dược liệu)