Để đánh giá sự thay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm, bao gồm tổng thời gian hoạt động trong ngày, thời gian thức và ngủ; chúng tơi tiến hành thí nghiệm bằng máy theo dõi hoạt động thức ngủ Trikinetics trong 7 ngày. Tần suất hoạt động của ruồi tại mỗi khoảng thời gian được ghi nhận là số lần ruồi di chuyển qua đèn laser cảm biến. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.5 và Hình 3.6.
34
Hình 3. 5. Kết quả xác định nhịp sinh học của ruồi giấm. Trục hồnh biểu thị các mốc thời gian trong một ngày. Trục tung biểu thị số lần vận động của ruồi.
Chú thích:
Canton-S (lơ chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.
Rugose (lơ chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ, khơng
được điều trị với BVNC.
Rugose + BVNC 2mg/ml, Rugose + BVNC 4mg/ml (lơ thử): ruồi giấm đột biến gen
rugose mang bệnh tự kỷ, được điều trị bằng cao BVNC ở các nồng độ tương ứng 2mg/ml và 4mg/ml. 0 10 20 30 40 50 60 70 12:30:00 15:00:00 17:30:00 20:00:00 22:30:00 1:00:00 3:30:00 6:00:00 8:30:00 11:00:00 13:30:00 16:00:00 18:30:00 21:00:00 23:30:00 2:00:00 4:30:00 7:00:00 9:30:00 12:00:00 14:30:00 17:00:00 19:30:00 22:00:00 0:30:00 3:00:00 5:30:00 8:00:00 10:30:00 13:00:00 15:30:00 18:00:00 20:30:00 23:00:00 Số lầ n vận đ ộng Đỉnh hoạt động ban đêm Đỉnh hoạt động ban ngày 0 10 20 30 40 50 0:00:00 2:30:00 5:00:00 7:30:00 10:00:00 12:30:00 15:00:00 17:30:00 20:00:00 22:30:00 1:00:00 3:30:00 6:00:00 8:30:00 11:00:00 13:30:00 16:00:00 18:30:00 21:00:00 23:30:00 2:00:00 4:30:00 7:00:00 9:30:00 12:00:00 14:30:00 17:00:00 19:30:00 22:00:00 0:30:00 3:00:00 5:30:00 8:00:00 Số lầ n vận đ ộng Chart Title
35
Hình 3. 6. Kết quả phân tích tổng số lần vận động trong thời gian 7 ngày.
* p < 0,05; ** p < 0,01 so sánh với lơ chứng bệnh lý (Rugose). Chú thích:
CantonS (lơ chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại.
Rugose : ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ.
BVNC 2mg/ml, BVNC 4mg/ml (lơ thử): ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự
kỷ, được điều trị bằng cao BVNC ở các nồng độ tương ứng 2mg/ml và 4mg/ml.
Kết quả xác định nhịp sinh học cho thấy cường độ hoạt động của cả 4 nhĩm ruồi cĩ sự lặp lại giữa các ngày theo dõi. Ruồi hoạt động chủ yếu vào hai thời điểm trong ngày tương ứng với hai đỉnh cĩ cường độ hoạt động cao nhất (Hình 3.5). Khoảng thời gian 6h-8h là đỉnh hoạt động ban ngày và 18h-20h là đỉnh hoạt động ban đêm.
Kết quả Hình 3.6 cho thấy tổng số lần hoạt động trong 7 ngày của ruồi giấm đột biến gen thấp hơn so với ruồi giấm chủng hoang dại, sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê với p<0,05. Cả hai nhĩm ruồi giấm đột biến gen rugose bệnh tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn BVNC ở 2 nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml đều cĩ tổng số lần hoạt động cao hơn so với nhĩm ruồi đột biến khơng dùng thuốc. Tuy nhiên, chỉ ở lơ BVNC 4mg/ml, sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,01.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 CantonS 0 BVNC 2mg/ml BVNC 4mg/ml Tổng số lần v ận đ ộng * ** Rugose
36
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về mơ hình nghiên cứu
4.1.1.Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm mang bệnh tự kỷ
Ruồi giấm cĩ tên khoa học là Drosophila melanogaster, đã được sử dụng trong lĩnh vực di truyền học với lịch sử nghiên cứu hơn 100 năm. Ngày nay, ruồi giấm vẫn được xem là mơ hình nền tảng tốt cho các nghiên cứu về mặt di truyền và sinh học trong các tình trạng bệnh lý [14] bởi rất nhiều ưu điểm trong nghiên cứu.
Về mặt đạo đức trong nghiên cứu, sử dụng ruồi giấm làm động vật nghiên cứu ít gặp phải các vấn đề liên quan tới đạo đức trong nghiên cứu y sinh học hơn là tiến hành thử nghiệm trên các động vật bậc cao hơn như chuột, chĩ, thỏ,... hay động vật cĩ vú như khỉ.
Về mặt sinh lý, ruồi giấm là sinh vật được hiểu rõ về quá trình sinh sản, chu trình phát triển từ phơi đến ấu trùng, đến ruồi trưởng thành. Ruồi giấm tuy nhỏ nhưng cĩ cấu trúc cơ thể hồn chỉnh, được tìm hiểu rõ về giải phẫu các cơ quan trong cơ thể. Đĩ là lợi thế để thiết kế thí nghiệm trên các giai đoạn và các bộ phận khác nhau.
Về mặt di truyền, ruồi giấm chỉ cĩ 4 cặp NST, do vậy việc thao tác, phân tích, sàng lọc di truyền dễ dàng thực hiện hơn. Hệ gen đã được lập bản đồ chi tiết cho phép so sánh, tra cứu các chức năng tương đồng với người. Đây là mơ hình thuận lợi và lý tưởng để nghiên cứu các bệnh liên quan đến yếu tố di truyền.
Về mặt kinh tế, thứ nhất, ruồi giấm là sinh vật kích thước nhỏ bé nên khơng địi hỏi diện tích mơi trường sống lớn hay lượng thức ăn quá nhiều. Thứ hai, ruồi giấm cái cĩ thể đẻ hàng trăm quả trứng trong suốt cuộc đời của nĩ, phơi tạo thành trong vịng 24 giờ sau khi trứng được thụ tinh và chỉ mất khoảng 10 ngày để phát triển thành ruồi trưởng thành. Điều này cho phép tạo ra một quần thể ruồi giấm lớn và liên tục phục vụ nghiên cứu, tiết kiệm cả về thời gian, chi phí cũng như cơng sức chăm sĩc, nuơi dưỡng.
Về ứng dụng của ruồi giấm trong lĩnh vực thần kinh và di truyền học, ruồi giấm cĩ cấu trúc não phân hĩa cao với 2 thùy và khoảng 100.000 tế bào thần kinh. Ruồi giấm cũng cĩ dây thần kinh phân đoạn giống như cột sống ở động vật cĩ vú [14]. Với cấu trúc hệ thần kinh hồn thiện và chức năng tương đồng trên người, ruồi giấm được
37
sử dụng làm mơ hình để nghiên cứu bệnh lý về thần kinh và vận động [38]. Các nhà khoa học trong và ngồi nước đã sử dụng ruồi giấm làm động vật nghiên cứu trong một số bệnh lý thần kinh như: parkinson, alzheimer, huntington, tự kỷ, hội chứng xơ cứng teo cơ một bên,... [14], [21], [62].
Dựa trên những ưu điểm và sự thuận tiện trong quan sát, định lượng, chúng tơi quyết định lựa chọn mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose bệnh tự kỷ để nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi thần kinh của BVNC trên bệnh tự kỷ.
Mặc dù cĩ rất nhiều ưu điểm, song mơ hình ruồi giấm cịn những nhược điểm tồn tại như giải phẫu não và các cơ quan rất khác với con người. Cùng với đĩ, ruồi thiếu khả năng nhận thức sâu sắc so với người và phương pháp đo lường xu hướng hành vi chưa được tồn diện. Do vậy, tác dụng của thuốc phản ánh trên ruồi cĩ thể khác biệt đáng kể so với các nghiên cứu trên người.
Nhìn chung, Drosophila melanogaster là sinh vật mơ hình phù hợp vì nhiều lý do mặc dù chúng cĩ nhược điểm nhất định. Mơ hình ruồi giấm cĩ vai trị sàng lọc nhanh chĩng các mẫu cĩ tiềm năng trong điều trị và hỗ trợ điều trị cho hội chứng rối loạn phổ tự kỷ. Xa hơn nữa cĩ thể nghiên cứu ảnh hưởng của mẫu tới các thay đổi di truyền, các đích cụ thể hoặc con đường tín hiệu liên quan.
4.1.2. Về việc lựa chọn dược liệu nghiên cứu
Bình vơi núi cao cĩ tên khoa học đầy đủ là Stephania brachyandra Diels, thuộc
chi Stephania Lour. Nhiều hoạt chất chiết từ các lồi trong chi Stephania Lour. đã
được nghiên cứu và cho thấy hiệu quả tác dụng trên thần kinh như như L- tetrahydropalmatin, (-) – stepholidin hay palmatin. Một nhĩm tác giả trong nước đã phân lập được các hoạt chất này trong củ lồi BVNC thu hái ở Sa Pa (Lào Cai).
BVNC được đánh giá là cĩ nguồn gen tương đối hiếm với Việt Nam. Rễ củ (củ) cĩ hoạt chất dùng làm thuốc an thần, giảm đau. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng BVNC là lồi cĩ hoạt chất với hàm lượng rotundin cao hơn so với các lồi bình vơi khác hiện cĩ tại Việt Nam. Rotundin là hoạt chất cĩ hiệu quả tốt, đã được thương mại hĩa, dùng rất nhiều làm thuốc an thần, gây ngủ, giảm đau, điều trị một số trường hợp rối loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh, mất ngủ dai dẳng nguyên nhân tâm thần.
38
Nhận thấy những tiềm năng này, chúng tơi lựa chọn Stephania brachyandra
Diels để đánh giá tác dụng cải thiện hành vi thần kinh trên mơ hình ruồi giấm đột biến
gen rugose bệnh tự kỷ.
4.1.3. Về căn cứ lựa chọn mức liều nghiên cứu
Kế thừa kết quả sàng lọc số lượng lớn mẫu trên ruồi giấm thuộc dự án FIRST (dưới sự tài trợ của ngân hàng thế giới do PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng chủ trì), kết hợp với việc nhĩm nghiên cứu tiến hành sàng lọc trên một dải nồng độ 10, 6, 4, 2, 1 mg/ml, dựa vào tỷ lệ sống sĩt của ruồi trưởng thành và sự cải thiện hành vi cộng đồng với các mức liều, chúng tơi nhận thấy nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml là phù hợp và đạt các tiêu chí để nghiên cứu sâu hơn.
4.2. Về các kết quả nghiên cứu
4.2.1. Đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ
Khiếm khuyết về tương tác xã hội là một trong những đặc trưng của người mắc ASD. Để đánh giá tác dụng cải thiện triệu chứng của BVNC, chúng tơi thực hiện mơ hình đánh giá khả năng tương tác cộng đồng trên ruồi giấm đột biến gen rugose bệnh tự kỷ.
Nghiên cứu của Simon và cộng sự [58] cho thấy sự khác biệt giới tính khơng ảnh hưởng đến hành vi tương tác cộng đồng trên ruồi. Vì vậy, chúng tơi thống kê dữ liệu trên cả quần thể bao gồm ruồi đực và ruồi cái. Tuy nhiên, để giảm ảnh hưởng của tương tác giới tính, ví dụ như giao phối, đến mơ hình hành vi, chúng tơi thực hiện thí nghiệm trên từng nhĩm ruồi đực và ruồi cái riêng rẽ.
Hình ảnh phân bố quần thể ruồi trong khơng gian và chỉ số khoảng cách đến con ruồi gần nhất trong Hình 3.1 cho thấy ruồi giấm mang gen đột biến bị giảm khả năng tương tác cộng đồng. Các cá thể ở nhĩm bệnh chứng đứng riêng lẻ và rải rác trong khơng gian, ít di chuyển thành từng đám giống như ở nhĩm ruồi giấm chủng hoang dại. Minh chứng cho điều này là khoảng cách gần nhất giữa hai cá thể ở nhĩm ruồi đột biến gen rugose tăng lên rõ rệt so với nhĩm ruồi giấm chủng hoang dại. Kết quả này phù hợp với các kết quả đã được cơng bố trên thế giới [58], [66] và sự khác biệt khoảng cách giữa các cá thể là do tương tác xã hội chứ khơng phải phân bố ngẫu nhiên [58].
39
Cao BVNC ở cả 2 mức liều 2 mg/ml và 4 mg/ml đều làm giảm khoảng cách ngắn nhất giữa hai cá thể ruồi giấm đột biến gen rugose. Trong đĩ, mức liều 4mg/ml cải thiện rõ rệt khả năng tương tác xã hội trên ruồi bệnh lý, khoảng cách giữa hai cá thể gần nhất được rút ngắn lại đáng kể với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê p < 0,001.
Như vậy, việc sử dụng cao BVNC cĩ tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng ở ruồi giấm đột biến gen rugose bệnh tự kỷ.
4.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ gen rugose mang bệnh tự kỷ
Sự thiếu hụt về khả năng học tập và ghi nhớ được ghi nhận ở một số nhĩm trẻ em mắc ASD. Chúng tơi sử dụng mơ hình đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm (Odor – taste learning) nhằm đánh giá hiệu quả tác dụng của cao chiết cồn BVNC lên khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ.
Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng khả năng ghi nhớ mùi ở lơ bệnh lý Rugose kém hơn hẳn so với lơ chứng sinh lý Canton-S cĩ ý nghĩa thống kê, cho thấy mơ hình hồn tồn phù hợp để đánh giá tác dụng của các mẫu trên cải thiện hành vi học tập - ghi nhớ. Ruồi giấm đột biến gen rugose thể hiện chức năng tương đồng với gen
neurobeachin ở người liên quan tới học tập, ghi nhớ. Kết quả này cũng hồn tồn
tương đồng với nghiên cứu trước đĩ của tác giả Volders và cộng sự [64].
Kết quả cao chiết cồn BVNC ở cả hai nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml cho thấy tác dụng cải thiện khả năng ghi nhớ. Chỉ số học tập ở hai nhĩm ruồi này tăng lên so với ruồi tự kỷ, sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Trong nghiên cứu của tác giả Volder cũng chỉ ra học tập ghi nhớ mùi trên ruồi giấm liên quan trực tiếp tới tế bào Kenyo, hình thành cấu trúc hình thái vùng MB (Mushroom body) thuộc thần kinh trung ương (CNS) của ruồi giấm [64]. Điều này gợi ý cho đích tác dụng của cao chiết cồn BVNC trên cấu trúc của MB thuộc hệ thần kinh trung ương, tuy nhiên vẫn cần nghiên cứu sâu hơn để khẳng định chính xác.
40
4.2.3. Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi vận động trên ấu trùng ruồi giấm bậc ba và ruồi giấm tự kỷ trưởng thành mang gen đột biến rugose.
4.2.3.1. Đánh giá khả năng di chuyển (bị) của ấu trùng ruồi giấm
Cải thiện tốc độ di chuyển là một tiêu chí nhằm đánh giá hiệu quả tác dụng của dược liệu lên chức năng vận động của ruồi giấm.
Kết quả Hình 3.3 và Hình 3.4 chỉ ra rằng ruồi giấm đột biến gen rugose bệnh tự kỷ cĩ tốc độ bị chậm hơn so với ruồi giấm chủng hoang dại. Ngồi ra, quan sát trong quá trình thực nghiệm cho thấy ruồi giấm mang gen đột biến cĩ xu hướng di chuyển cuộn trịn, ít tuyến tính so với đường đi của nhĩm ruồi sinh lý. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đĩ của Wise và cộng sự [66]. Sự khác biệt giữa lơ chứng sinh lý và lơ chứng bệnh lý cho thấy đây là mơ hình phù hợp để đánh giá tác dụng của cao BVNC.
BVNC nồng độ 4mg/ml cho thấy tác dụng cải thiện chức năng vận động của ruồi giấm, làm tăng 19 % tốc độ di chuyển trung bình của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen, sự khác biệt đạt ý nghĩa với p < 0,01. Trong khi đĩ, ở mức liều thấp hơn là 2mg/ml, BVNC khơng thể hiện hiệu quả tác dụng. Điều này cho thấy tác dụng thay đổi hành vi vận động trên ấu trùng của BVNC phụ thuộc vào liều nghiên cứu.
Trong quá trình phát triển, hệ thống NMJ phát triển theo sự tăng cường kích thước của các sợi cơ để đảm bảo duy trì sự chính xác của các synap điều khiển. Từ lúc nở tới giai đoạn phát triển thứ 3 của ấu trùng thì diện tích bề mặt sợi cơ tăng tới 100 lần [37]. Trong giai đoạn phát triển, số lượng nút thần kinh cũng tiếp tục tăng (một số bị loại bớt), kết quả của quá trình này là tăng số lượng các nút và số các vùng hoạt động của mỗi nút lên 10 lần [16]. Các hiện tượng tối ưu và cân bằng nội, thay đổi điện thế sinh lý cũng làm thay đổi giải phĩng chất dẫn truyền trung gian thần kinh và/hoặc đáp ứng hậu synap [45]. Liên hệ với một số nghiên cứu trước đây dựa trên phân tích cấu trúc thần kinh cơ NMJ tại nhĩm cơ số 4 của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang, chúng tơi nhận thấy cĩ mối liên quan [11], [50].Trong các nghiên cứu này, khi ruồi giấm chủng Rugose được điều trị bằng các cao chiết, đã cĩ sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ, cụ thể là số lượng, diện tích các nút thần kinh, chiều dài sợi thần kinh. Nhờ đĩ, cĩ sự thay đổi trong khả năng vận
41
động. Do đĩ, đây cũng cĩ thể là đích tác dụng của cao chiết cồn BVNC trên ấu trùng ruồi giấm bậc ba. Tuy nhiên, cần thực hiện các nghiên cứu sâu hơn để kiểm chứng.
4.2.3.2. Đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm
Thay đổi nhịp sinh học là một tình trạng phổ biến ở trẻ mắc ASD. Mơ hình đánh giá nhịp sinh học được tiến hành trên đối tượng ruồi trưởng thành giống đực vì hoạt