21
Bƣớc 1: Xác định khối lƣợng cao cần lên cột, từ khối lƣợng cao ta lựa chọn cột pha đảo có kích thƣớc phù hợp để lên cột.
Bƣớc 2: Khảo sát hệ dung môi lựa chọn lên cột bằng cách chấm TLC pha đảo với các tỷ lệ dung môi khác nhau. Sau đó dựa vào kết quả TLC pha đảo thu đƣợc mà quyết định lựa chọn hệ dung môi ban đầu để luyện và lên cột.
Bƣớc 3: Dùng hệ dung môi để lên cột ban đầu luyện cột, sao cho lƣợng dung môi chạy liên hết 2 lần silicagel trên cột.
Bƣớc 4: Cho cao lên cột: khóa cột khi dung môi trên cột vừa chạy hết trên bề mặt silicagel. Hòa tan lƣợng cao cần lên cột với một lƣợng tối thiểu methanol thu đƣợc dịch methanol - cao, bổ sung hết lƣợng dịch methanol - cao trên lên cột. Sau đó mở khóa cột, ngay khi lƣợng dịch methanol - cao thấm hết vào silicagel thì bổ sung một lƣợng nhỏ dung môi lên cột ban đầu. Sau khi lƣợt dung môi này di chuyển hết vào silicagel thì bổ sung từ từ dung môi chạy cột ban đầu và bắt đầu hứng dịch rửa giải.
Bƣớc 5: Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa đƣợc hứng bằng ống thủy tinh. Hệ dung môi trong quá trình chạy cột đƣợc thay đổi dựa theo kết quả chấm TLC, theo nguyên tắc giảm dần độ phân cực của hệ. Dịch rửa giải trong các ống đƣợc gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng. Có thể sử dụng HPLC kết hợp với TLC để kiểm tra các ống sạch trong quá trình chạy cột.
Bƣớc 6: Rửa cột: Sau khi xác định hết chất trên cột bằng TLC, tiến hành rửa cột bằng dung dịch Methanol-acid (100ml methanol + 1ml HCl) và sau đó rửa lại cột bằng methanol (200 - 400ml).