Nguyên tắc:
Phƣơng pháp tách các chất bằng HPLC điều chế dựa trên trạng thái cân bằng giữa các thành phần chất hấp phụ trong cột (pha tĩnh) và dung môi chảy qua nó (pha động). Khi một thành phần liên kết với pha tĩnh, đó là sự hấp phụ, khi thành phần này bị tách ra khỏi hỗn hợp nhờ pha động, đó là sự phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần chất nghiên cứu với pha tĩnh chính là khả năng lƣu giữ các thành phần này trên cột lâu hơn. Vì thế, thành phần đó sẽ đƣợc rửa giải ra khỏi cột chậm hơn các thành phần khác. Nhƣ vậy, việc tách riêng các chất từ một hỗn chất nghiên cứu chỉ
22
có thể tiến hành đối với các chất có khả năng hấp phụ khác nhau đối với pha tĩnh và phần hấp phụ đối với pha động.
Lựa chọn dung môi: Pha thuận thƣờng đƣợc chạy với dung môi hữu cơ thƣờng là hexan, heptan, cyclohexan cloroform, acetonitril, methanol. Pha động rửa giải thƣờng là các dung môi thân nƣớc nhƣ nƣớc, ester. Axit hữu cơ thƣờng thêm vào để giảm thiểu hiệu ứng trao đổi ion do những nhóm silanol tạo ra. Pha đảo đƣợc sử dụng trong môi trƣờng đệm thân nƣớc khi hấp phụ kị nƣớc giữa chất cần tinh chế và pha tĩnh bị xáo trộn vì sự tăng dần nồng độ một dung môi hữu cơ có thể hòa lẫn.
Phƣơng pháp phát hiện và thu nhận kết quả của HPLC điều chế: Có nhiều loại detector để phát hiện trong HPLC điều chế, phổ biến nhất là UV-VIS detectors và refractive index detector. UV-VIS detectors đƣợc sử dụng rộng rãi để khảo sát các chất có hấp thụ bức xạ tử ngoại trong khoảng 200 nm đến 850 nm. Refractive index detector sử dụng rất hiệu quả để tinh chế các chất do có tính năng rút một phần rất nhỏ của chất lỏng rửa giải từ cột sắc ký vào các mô-đun của đầu dò để thu hồi chất cần điều chế.
Cách tiến hành:
Bƣớc 1: Khảo sát hệ dung môi sử dụng:
- Chấm TLC pha đảo với mẫu cao cần lên cột với tỷ lệ hỗn hợp dung môi thích hợp. Lựa chọn hệ dung môi cho kết quả phân tách tốt các vết trên bản mỏng pha đảo. Hòa tan hoàn toàn mẫu trong 2-3ml methanol (Merk), lọc bỏ cặn.
- Chạy thử 0,5 µL mẫu cao đã hòa tan trong methanol (Merk) bằng HPLC với hệ dung môi và chƣơng trình đƣợc lựa chọn để khảo sát độ tách thực tế của các chất trong mẫu thông qua các peak và thời gian lƣu của các chúng trên sắc kí đồ.
Bƣớc 2: Chạy HPLC điều chế với lƣợng mẫu cao lớn 500µL/ lần, chạy 2-3 lần với chƣơng trình phù hợp đã khảo sát và quan sát peak để hứng chất.
- Gộp các chất có thời gian lƣu tƣơng tự nhau ở các lần chạy HPLC điều chế lại với nhau, làm bay hơi dung môi, thu chất.
Bƣớc 3: Kiểm tra lại các chất thu đƣợc bằng TLC pha thƣờng và pha đảo để quyết xem chất nào có thể đem đi đo phổ NMR, phổ khối (MS).