Sắc kí là một phƣơng pháp vật lý dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh). Khi đó, một hỗn hợp nhiều hợp chất khác nhau khi đƣợc đặt vào một hệ thống hai pha, mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì thế sẽ tƣơng tác mạnh - yếu khác nhau với đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau, nhờ vậy kĩ thuật sắc kí có thể tách riêng các loại hợp chất.
Trong nghiên cứu này, các phân đoạn của vỏ thân đƣợc phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thƣờng (Merck), sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 và HPLC điều chế. Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF254 (Merck), RP- 18 (Merck). Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn. Sắc ký đồ (TLC) đƣợc quan sát dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
2.3.2.1 Phân lập bằng sắc ký cột
Nguyên tắc
Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn đƣợc nhồi trong cột thủy tinh. Có thể triển khai liên tục với các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh. Chất nhồi cột là silica gel pha thƣờng hoặc silica gel pha đảo.
20
Cột thủy tinh: chọn cột thủy tinh thành dày thích hợp, chiều dài cột gấp 3 lần thể tích silicagel cần thiết cho quá trình phân lập.
Pha tĩnh: lựa chọn pha tĩnh phụ thuộc vào độ phân cực của mẫu cần tách. 2.3.2.1.1. Phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thƣờng (Merck)
Cách tiến hành:
Bƣớc 1: Xác định khối lƣợng cao cần lên cột.
Bƣớc 2: Khảo sát hệ dung môi lựa chọn lên cột bằng cách chấm TLC pha thƣờng với các tỷ lệ dung môi khác nhau. Sau đó dựa vào kết quả TLC mà lựa chọn hệ dung môi thích hợp ban đầu để tiến hành lên cột.
Bƣớc 3: Cân một lƣợng silicagel pha thƣờng bằng 3 lần lƣợng mẫu cao cần lên cột. Lựa chọn cột sao cho lƣợng silicagel sau khi cho vào cột sẽ cao khoảng 20cm. Hòa lƣợng silicagel trên vào khoảng 1000 ml dung môi đã đƣợc lựa chọn để lên cột ban đầu thu đƣợc hỗn dịch DM- silicagel.
Đồng thời cao mẫu cần đƣa lên cột sẽ trộn với một lƣợng silicagel tối thiểu để thu đƣợc hỗn hợp cao – silicagel tơi xốp, hỗn hợp này đƣợc đem vào tủ sấy 50o C, sấy trong 8h.
Bƣớc 4: Lót bông dƣới cột đã chọn, cho hỗn dịch DM-sicagel lên cột, mở khóa, thu dung môi, chạy luyện cột 2-3 lần bằng lƣợt dung môi thu đƣợc. Ngâm silicagel trên cột trong dung môi trong 24h trƣớc khi cho hỗn hợp cao-silicagel đã đƣợc sấy lên cột.
Bƣớc 5: Cho mẫu cao lên cột: Hỗn hợp cao-silicagel đƣợc nghiền nhẹ trƣớc khi bổ sung lên cột. Sau khi cho hỗn hợp cao-silicagel lên cột hoàn toàn thì bổ sung dung môi đƣợc lựa chọn ban đầu lên từ từ cho tới khi thấm ƣớt hoàn toàn cao-silicagel. Mở cột, hứng dung môi rửa giải.
Bƣớc 6: Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa đƣợc hứng bằng ống thủy tinh. Trong quá trình chạy cột thì dung môi sẽ đƣợc thay đổi tỷ lệ phù hợp theo nguyên tắc tăng dần độ phân cực của hệ dung môi (đi từ hệ dung môi kém phân cực đến hệ dung môi phân cực hơn). Dịch rửa giải trong các ống đƣợc gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng.