trưng cho từng nhóm theo các tài liệu [2], [3].
2.4.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các chất phân lập được được
2.4.2.1. Phương pháp chiết xuất
Dược liệu được chiết bằng phương pháp chiết nóng với dung môi là EtOH 70%. Dịch chiết ethanol được gộp lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao tổng.
Cao tổng được phân tán với nước nóng, chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat. Dịch chiết các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, dịch chiết nước còn lại được cô cách thủy ở nhiệt độ 80℃, thu được cao các phân đoạn tương ứng: cao n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat và cắn nước.
2.4.2.2. Phương pháp phân lập chất
Trước khi tiến hành phân lập chất, khảo sát cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn pha động phù hợp. Sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập các chất. Các bước tiến hành như sau:
• Lựa chọn chất nhồi cột (pha tĩnh): Silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (Merck).
• Dung môi rửa giải (pha động): Hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng:
n-hexan, dichloromethan, aceton, ethyl acetat, methanol theo tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát trước đó bằng sắc ký lớp mỏng.
• Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng chất đưa lên cột, được rửa sạch, tráng bằng aceton, phơi khô, cố định trên giá theo phương thẳng đứng. Lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột.
• Nhồi cột: Đưa lượng silica gel phù hợp vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải, khuấy đều để phân tán silica gel thấm đều dung môi và đuổi hết bọt khí. Cho hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị. Mở khóa cột, rót tiếp dung môi để cột hết bọt khí và ổn định. Sau khi cột đã ổn định, giữ lại một ít dung môi (cao khoảng 3-5 cm tính từ bề mặt trên của lớp silica gel) để cột không bị khô trước khi khóa cột lại và chuẩn bị đưa mẫu lên cột.
• Chuẩn bị mẫu: Mẫu cao phân đoạn được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến khi tan hoàn toàn, sau đó trộn đều với một lượng silica gel (tối thiểu), phân tán đều trong lượng silica gel trên; làm khô để loại bỏ dung môi và nghiền, trộn đến khi thu được bột khô, tơi, mịn.
• Nạp mẫu: Đưa từ từ mẫu lên cột, tránh vón cục và lẫn bọt khí bằng cách rắc từ từ lên lớp silica gel đã được nhồi trước đó. Sau khi nạp mẫu xong, thêm một lớp bông lên trên để tránh xáo trộn bề mặt mẫu khi thêm dung môi.
• Rửa giải: Cho hệ dung môi rửa giải thích hợp lên cột đã được nạp mẫu. Trong quá trình rửa giải, liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô.
• Thu dịch: Hứng dịch rửa giải từ cột bằng các lọ và ống nghiệm với lượng thể tích trong mỗi ống phù hợp. Kiểm tra dịch thu được bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng để có thể xác định và gộp các lọ, các ống có cùng sắc ký đồ thành các phân đoạn riêng biệt. Loại dung môi thu được cắn, chuyển cắn vào các lọ đựng mẫu nhỏ để bảo quản và tiến hành các kỹ thuật phân tích sau đó.
• Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
2.4.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập được
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính cảm quan, khối phổ (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trước đó.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN