5. Điểm mới của đề tài
2.3 Chiết hợp chất từ cây tai tượng Ấn
Quy trình điều chế cao chiết từ cây tai tượng Ấn
Nguyên liệu được sử dụng trong luận án là lá cây tai tượng Ấn được thu hái vào đầu tháng 4, trên đường Kalijudan Barat, thành phố Surabaya, Indonesia. Nguyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm 10 ngày và được xay thành bột thô với độ ẩm của nguyên liệu ban đầu là 6,35%.
Sử dụng hệ thống trích ly nóng để tổng hợp cao chiết. Cân lấy 10 g bột thô của lá cây tai tượng Ấn đã được chuẩn bị trước đó cho vào bình cầu 2 cổ đáy tròn, thêm vào 50 mL dung môi (ethanol 99,5%, nước cất). Tiến hành đun sôi hỗn hợp và duy trì nhiệt độ sôi trong khoảng 15 phút, gạn lấy dịch chiết. Quy trình được lặp lại 3 lần với cùng điều kiện nhiệt độ và áp suất, lượng dung môi, thời gian. Gộp chung dịch chiết của ba lần chiết rồi đem đi cô quay thu được 2 mẫu cao của lá cây tai tượng Ấn được trích xuất từ hai loại dung môi khác nhau là ethanol (99,5%) và nước.
31
Các phương pháp kiểm tra hoạt tính sinh học cao chiết
2.3.2.1 Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn E.coli
Khuẩn E.coli chưa được hoạt hóa được cung cấp bởi bộ môn vi sinh, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
Để so sánh khả năng kháng khuẩn của hai mẫu cao chiết ta sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch bằng cách xác định và so sánh đường kính kháng khuẩn của hai mẫu cao ở các nồng độ khác nhau. Chuẩn bị các đĩa petri với 25 mL hỗn hợp Nutrient Broth 1,3% (w/w) và agar 2,3% (w/w).
Ampicillin 1000 ppm được sử dụng làm đối chứng dương. Nước cất hai lần đã được vô trùng làm đối chứng âm. Các đĩa được ủ trong 24 h ở 37 °C. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của 4 nồng độ chiết xuất khác nhau (50,00; 10,00; 5,00 và 1,00 mg/mL) của hai mẫu cao được ghi lại bằng mm và thí nghiệm được lặp lại hai lần.
2.3.2.2 Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH
Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH). Phản ứng được tiến hành dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy UH-5300 Hitachi ở bước sóng 519 nm.
Cách tiến hành:
Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại: Mẫu dung dịch DPPH 50 μM được quét bước sóng trong thiết bị UV-vis với bức xạ có bước sóng từ 300 đến 600 nm và ghi nhận lại bước sóng cho độ hấp thu cực đại. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và giá trị trung bình của bước sóng cho độ hấp thu cực đại được chọn để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. Từ các bước được mô tả như trên, bước sóng hấp thu cực đại được chọn là 519 nm.
32
Hình 2.2 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Lấy V1 (µL) cao trích cho vào ống nghiệm rồi bổ sung V2 (µL) EtOH 99,5% thu được dung dịch hỗn hợp. Thêm tiếp dung dịch DPPH 100 µM, lắc đều. Để yên hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối và đo độ hấp thu ở bước sóng 519 nm bằng máy đo quang phổ UV-vis (UH300). Ethanol được dùng như là mẫu trắng. Acid gallic được dùng làm chất chuẩn được pha ở các nồng độ 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 µM. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Mỗi mẫu ban đầu được thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100,0; 50,0; 25,0; 10,0 µg/mL.Nếu hoạt tính của mẫu thử mạnh ta sẽ thử tiếp ở các nồng độ thấp hơn 10,0; 5,0; 2,0; 1,0 µg/mL để tìm IC50. Giá trị IC50 được xác định thông qua nồng độ chất thử và phần trăm hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử.
Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH được tính dựa theo công thức sau : DPPH (%) = 𝐴0− 𝐴1
𝐴0 ∗ 100%
Trong đó: A0: độ hấp thu quang khi không có mẫu, A1 là độ hấp thu của hỗn hợp mẫu và DPPH. Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (IC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị IC50. Giá trị IC50 được xác định thông qua nồng độ chất thử và phần trăm hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử.
33
2.3.2.3 Xác định năng lực khử
Quá trình khử Fe (III) thường được dùng để chỉ thị khả năng nhường electron của các chất kháng oxy hóa như polyphenol. Mẫu thử sẽ khử ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)6]). Phức hợp của Fe2+ hình thành sau đó có thể đo được tại bước sóng 700 nm. Sự tăng độ hấp thu tại bước sóng này cho thấy sự gia tăng về đặc tính khử của mẫu. Tiến hành pha dung dịch mẫu gốc có nồng độ 1 mg/mL với dung môi là dung dịch đệm phosphate 2,0 M, pH = 6,6. Đem mẫu đi đánh siêu âm để mẫu tan hoàn toàn. Từ dung dịch mẫu gốc pha dung dịch mẫu có nồng độ 0,5 mg/mL và 0,1 mg/mL. Hút 1,0 mL dung dịch các mẫu trên cho vào ống nghiệm thêm vào 1,0 mL đệm phosphate 2,0 M, pH = 6,6 và 1,0 mL potassium hexacyanoferrate (K3[Fe(CN)6]) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50ºC trong 20 phút ở bể điều nhiệt. Sau đó, bổ sung thêm 1,0 mL acid trichloroacetic (TCA) 10%. Lấy 1,0 mL dung dịch phối trộn với 1,0 mL nước cất và 0,2 mL ferric chloride (FeCl3) 0,1%. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự nhưng không cho FeCl3
(0,1%). Ghi lại giá trị mật độ quang tại bước sóng 700 nm. Giá trị mật độ quang càng cao thì khả năng khử càng mạnh.
34
2.3.2.4 Xác định tổng hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định bằng phương pháp folin-ciocalteu với một vài thay đổi: Dịch chiết của lá cây tai tượng Ấn được trộn với thuốc thử folin-ciocalteu (FC) đã pha loãng với nước (tỷ lệ 1:5) và dung dịch sodium carbonate (Na2CO3) nồng độ 10% (w/w). Độ hấp thu ở bước sóng 770 nm được đo lường bởi máy quang phổ UV- vis (UH300) sau 30 phút ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Acid gallic được sử dụng làm đường chuẩn. Kết quả hàm lượng polyphenol của cao trích thực vật được diễn đạt theo mg đương lượng acid gallic trên gam mẫu (mg GAE/g).
Cách tiến hành:
Quy trình xác định tổng hàm lượng polyphenol được tóm tắt như Hình (2.4). Lấy 1300 µL dung dịch mẫu nồng độ 20 μg/mL trộn với thuốc thử Folin (đã pha loãng 5 lần) lắc đều rồi để yên hỗn hợp trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 700 µL Na2CO3 10% (w/w). Độ hấp thu được ghi lại sau 30 phút ủ hỗn hợp trong bóng tối ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch mẫu thử Na2CO3 Đo mật độ quang - Lắc đều - Để yên 5 phút - Thêm nước cất đến 3000μL - Lắc đều - Ủ 30 phút trong bóng tối Thuốc thử FC
Hình 2.4 Quy trình xác định hàm lượng polyphenol tổng
Hàm lượng polyphenol tổng số theo phần trăm chất khô được tính dựa vào đường chuẩn của acid gallic trong khoảng nồng độ 120 μg/mL theo công thức (2.7).
35 PP = 𝑋.𝑉
𝑚.(1−𝑤) (2.7)
Trong đó:
PP: Tổng hàm lượng polyphenol (mg GAE/g mẫu) V(ml): Thể tích dược liệu sử dụng
X (μg/mL): Nồng độ của acid gallic được xác định dựa trên đường chuẩn m (μg): Khối lượng dược liệu sử dụng
w (%): Độ ẩm của vật liệu