2.2.1.Sơ đồ nghiên cứu
Màng lọc PET
Khảo sát nồng độ đồng sulfat ban đầu (M)
Khảo sát hàm lượng PVP (%)
Khảo sát thời gian phản ứng
PET tối ưu
Đánh giá hình thái và kích thước hạt nano đồng
Xác định lượng đồng bị rửa trôi
Đánh giá mức độ tổn thương của tế bào E. coli
Hình 2. 2. Sơ đồ tiến trình thực hiện nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, mẫu PET – nano đồng sẽ được đánh giá dựa trên tiêu chí lượng đồng bám được lên màng và khả năng kháng khuẩn trên Escherichia coli và
Staphylococcus aureus. Mục tiêu của nghiên cứu là tìm ra điều kiện tổng hợp nano đồng có
khả năng kháng khuẩn tốt nhất mà không tiêu tốn quá nhiều lượng đồng hay chất bao sử dụng. Do đó, thí nghiệm được tiến hành bằng cách thay đổi 3 yếu tố lần lượt là nồng độ CuSO4 ban đầu, hàm lượng PVP và thời gian phản ứng. Mẫu tối ưu sẽ được sử dụng để chụp ảnh SEM và được phân tích phổ EDX nhằm xác định nguyên tố, kích thước và sự phân bố, sau đó sẽ được sử dụng để đo lượng đồng rửa trôi trong dịch lọc bằng phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry hay ICP – MS). Đồng thời dịch tế bào vi khuẩn sau khi bị xử lí với nano đồng cũng sẽ được chụp SEM nhằm quan sát và đánh giá hình thái tế bào bị tổn thương của đối
26 tượng. Tất cả các mẫu màng lọc PET – nano đồng sẽ được mã hoá để thuận tiện cho việc gọi tên và nhận biết.
Bảng 2. 4. Qui ước mã hoá mẫu màng lọc PET trong nghiên cứu
Điều kiện khảo sát Kí hiệu
Nồng độ CuSO4 ban đầu (M)
0,4 CuSO4_0,4 0,6 CuSO4_0,6 0,8 CuSO4_0,8 1,0 CuSO4_1,0 1,2 CuSO4_1,2 1,4 CuSO4_1,4 Hàm lượng PVP (%) 0,42 PVP_0,42 0,6 PVP _0,6 0,8 PVP _0,8 1,0 PVP _1,0 1,2 PVP _1,2 1,4 PVP _1,4 Thời gian phản ứng (phút) 10 t10 20 t20 45 t45
(Các mẫu sau sử dụng mẫu tối ưu ở điều kiện trước để khảo sát)
2.2.2.Phương pháp tổng hợp nano đồng trên màng PET
Trong nghiên cứu này, nano đồng được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học dựa trên qui trình của Rezaie & Montazer (2017) cải biên. Màng lọc PET sẽ được ngâm trong dung dịch KOH 10M trong vòng 60 phút, KOH sau đó được loại bỏ hoàn toàn bằng 40ml×4 nước cất và được kiểm tra lại bằng dung dịch phenolphtalein. Sau khi làm khô ở nhiệt độ phòng, lưới PET đã xử lí sẽ được cho vào 48ml dung dịch chứa sodium hypophosphite (0,68% w/v), polyvinylpyrrolidone (0,42 – 1,4% w/v) và 1 ml dung dịch CuSO4 (0,4 – 1M). Tiến hành đun cách thủy hỗn hợp ở 100°C trong vòng 15 phút. Triethanolamine (TEA) được thêm vào dung dịch với thể tích 1 ml sao cho nồng độ đạt 0,03% (v/v) trong dung dịch tổng. Hỗn hợp tiếp tục được đun cách thuỷ trong vòng 45 phút. Mẫu màng lọc PET sau khi xử lí sẽ được rửa với 40×4 (ml) nước cất để loại bỏ hoàn toàn các hạt nano đồng tự do và các chất tan khác. Sau đó, mẫu được làm khô bằng máy sấy cầm tay ở 40 – 50°C và được bảo quản trong túi nhựa.
27
2.2.3.Xác định tỉ lệ hao hụt khối lượng so với ban đầu sau khi ngâm kiềm màng PET
Tỉ lệ hao hụt khối lượng của màng PET được xác định bằng cách cân khối lượng các mẫu màng PET đã được ngâm với dung dịch KOH 10M trong 30, 60, 90, 135 phút. Tất cả các mẫu PET sau khi ngâm kiềm đều được rửa bằng nước cất để loại bỏ hoàn toàn KOH và được sấy khô ở 55°C trong vòng 3 giờ trước khi được cân khối lượng.
2.2.4.Xác định hàm lượng nano đồng bám lên màng PET
Hàm lượng đồng trên màng lọc PET được xác định bằng phương pháp của Yoe & Barton (1940) cải biên. Màng lọc PET – nano đồng được ngâm vào trong dung dịch chứa 6 ml HNO3 2M, sau đó được gia nhiệt lên 70°C trong vòng 10 phút để chuyển tất cả nano đồng và đồng oxide thành ion Cu2+ theo phương trình (2.1), (2.2) và (2.3).
3Cu + 8HNO3 → 3Cu(NO3)2 + 2NO + 4H2O (2.1) CuO + 2HNO3 → Cu(NO3)2 + H2O (2.2) 2Cu2O + 8HNO3 → 4Cu(NO3)2 + 2H2O (2.3) Màng lọc PET được rửa với 14 ml nước cất nhằm loại bỏ các chất tan còn lại. Hỗn hợp nước rửa và hỗn hợp acid dư được kết hợp thành 1 hỗn hợp mới. Tiến hành thêm 3,5 ml KOH 3M để trung hoà gần hết acid còn dư trong dung dịch. Tiếp tục thêm 3 ml triethanolamine (TEA) 0,5M vào hỗn hợp để tạo phức màu xanh đậm với ion Cu2+.
Hình 2. 3. Đường chuẩn xác định nồng độ đồng tại bước sóng 650 nm
Để xác định bước sóng có độ hấp thụ cực đại của dung dịch trên, phương pháp quét quang phổ dung dịch được tiến hành trong khoảng bước sóng từ 400 – 700 nm, sử dụng mẫu nước cất làm mẫu trắng. Kết quả cho thấy bước sóng có độ hấp thụ cực đại của dung dịch đạt 650 nm (Phụ lục 13). Điều này tương đồng với kết quả của Yoe & Barton (1940), do đó
y = 70.359x + 0.0045 R² = 0.9943 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 ABS Nồng độ Cu(NO3)2(M)
28 bước sóng trên được lựa chọn để đo độ hấp thụ cho tất cả các dung dịch đồng trong suốt thí nghiệm. Hàm lượng nano đồng bám lên màng lọc PET sẽ được xác định thông qua đường chuẩn ở Hình 2.3.
2.2.5.Đánh giá khả năng diệt khuẩn của màng PET gắn nano đồng
Phương pháp đánh giá khả năng diệt khuẩn được dựa trên nghiên cứu của Zain et al. (2014) cải biên. Chủng giống Escherichia coli NBRC 14237 và Staphylococcus aureus được bảo quản ở nhiệt độ dưới 4°C và được cấy truyền vào môi trường Nutrient Broth (NB), sau đó được nuôi cấy ở 37°C trong vòng 24 giờ. Chủng giống tươi sau khi nuôi cấy có mật độ vi khuẩn ban đầu xấp xỉ 107 (cfu/ml). Tiến hành pha loãng huyền phù sinh vật với dung dịch nước muối sinh lý (0,9% NaCl) để đạt được mật độ vi khuẩn ban đầu xấp xỉ 102 – 104 (cfu/ml) và sử dụng mật độ trên để đánh giá tính kháng khuẩn của màng lọc PET – nano đồng.
Để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng lọc PET – nano đồng, dịch huyền phù vi sinh vật có thể tích đạt 8,0 ml với mật độ ban đầu đạt 102 – 104 (cfu/ml) được bơm qua màng lọc PET – nano đồng với tốc độ bơm 0,53 ml/phút trong vòng 15 phút. Màng lọc PET – nano đồng được cố định trong khung lọc (holder) trong suốt quá trình lọc. Dịch lọc sau đó được trải đĩa trên môi trường thạch Agar – NB và ủ trong tủ cấy ở 37°C trong vòng 24 giờ. Mật độ vi khuẩn sau xử lí sẽ được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Trong nghiên cứu này, khả năng kháng E. coli và S. aureus sẽ được biểu diễn thông qua mật độ sinh khối bị giảm (Log reduced hay Log red) so với mật độ sinh khối ban đầu, và được xác định theo công thức sau:
𝐿𝑜𝑔 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑒𝑑 = 𝐴1− 𝐴2
Trong đó: Log reduced là mật độ sinh khối bị giảm (cfu/ml); A1 là mật độ vi khuẩn
ban đầu (cfu/ml); A2 là mật độ vi khuẩn sau xử lí (cfu/ml).
Hiệu suất tiêu diệt vi khuẩn được xác định theo công thức sau:
𝐻 = 𝐴1 − 𝐴2
𝐴1 × 100%
Trong đó: H là hiệu suất tiêu diệt vi khuẩn (%); A1 là mật độ vi khuẩn ban đầu
(cfu/ml); A2 là mật độ vi khuẩn sau xử lí (cfu/ml).
2.2.6.Xác định kích thước và sự phân bố của nano đồng trên màng PET
Kích thước và sự phân bố của nano đồng trên màng lọc PET được xác định bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) kết hợp đo phổ tán sắc năng lượng tia X (Energy – dispersive X
29 – ray spectroscopy hay EDX). Sự phân bố của hạt nano đồng được xác định bằng cách chọn ngẫu nhiên 150 hạt nano trên ảnh chụp SEM, sau đó tiến hành xử lí với phần mềm ImageJ (version 1.49u), từ đó vẽ được biểu đồ phân bố của các hạt nano với kích thước tương ứng.
2.2.7.Xác định hình thái và tổn thương của vi khuẩn trước và sau khi xử lí nano
Hình thái và tổn thương của vi khuẩn trước và sau khi bị lọc qua màng PET – nano đồng được xác định bằng phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM). Mẫu vi khuẩn trước và sau khi xử lí với nano đồng sẽ được xử lí theo qui trình của Arakha et al. (2015) và De et al. (2008) cải biên trước khi tiến hành chụp SEM. Dịch huyền phù vi sinh vật sẽ được chuyển lên phiến kính hình chữ nhật (diện tích 1 cm2) bằng que cấy vòng vô trùng và được cố định bằng 1 giọt dung dịch glutaraldehyde 2,5%. Sau đó, mẫu sẽ được cố định vị trí bên trong đĩa petri vô trùng và ủ trong 24 giờ ở 37°C. Tiến hành ngâm mẫu với nhiều nồng độ cồn (30, 50, 70, 90 và 100%), thời gian ngâm trong mỗi nồng độ là 10 phút nhằm loại bỏ triệt để lượng nước trong tế bào. Mẫu sau khi được xử lí sẽ được phủ một lớp bạch kim mỏng và tiến hành chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).
2.2.8.Xác định lượng đồng bị rửa trôi trong dung dịch
Lượng đồng bị rửa trôi trong quá trình xử lí dung dịch qua màng lọc nano đồng được xác định bằng phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry hay ICP – MS). Đây là một trong những phương pháp nhằm xác định dấu vết của các nguyên tố kim loại trong nước và chất thải bằng cách sử dụng áp lực khí nén phun dung dịch mẫu qua khu vực có tần số plasma. Các ion ở dạng trung hòa sẽ được các tia plasma tách ra (quá trình ion hóa) để tạo thành dạng điện tích tự do. Lượng điện tích này được xác định bằng cách sử dụng quang phổ electron (Long, 1989). Mẫu được chuẩn bị bằng cách bơm 1 (L) nước cất đi qua 1 màng lọc nano đồng được cố định bên trong khung lọc (holder) với tốc độ bơm đạt 0,83 ml/phút. Mẫu đối chứng được sử dụng là mẫu nước cất với cùng nguồn gốc và thể tích. Tất cả các phép đo ICP – MS sẽ được tiến hành bởi Trung Tâm Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3.
2.2.9.Phương pháp xử lí số liệu
Sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê giữa các điều kiện thí nghiệm được xử lý ANOVA bằng phần mềm SPSS (Version 20.0, SPSS, Chicago, IL, USA) và Excel 2013.
30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của thời gian xử lý kiềm đến khối lượng của màng lọc
Thời gian xử lí kiềm là một trong các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đính nano đồng lên bề mặt sợi PET. Cơ chế của hiện tượng trên có thể được giải thích thông qua phản ứng thuỷ phân liên kết ester của sợi PET bằng dung dịch kiềm KOH 10M, tạo ra các rãnh chứa các gốc COO‾ có khả năng giữ hạt nano kim loại. Để kiểm chứng giả thiết trên, tỉ lệ hao hụt khối lượng của màng lọc PET khi ngâm trong dung dịch kiềm được tiến hành khảo sát với các khoảng thời gian khác nhau.
Hình 3. 1. Tỉ lệ hao hụt khối lượng màng lọc PET khi xử lí kiềm
Kết quả cho thấy tỉ lệ hao hụt khối lượng tăng đáng kể khi tăng thời gian ngâm trong dung dịch kiềm của các màng PET. Về mặt ngoại quan, cấu trúc của màng lọc PET có xu hướng yếu đi khi tăng thời gian xử lí kiềm. Đối với mẫu ngâm kiềm trong 135 phút, cấu trúc màng rất yếu và dễ dàng bị kéo rách so với mẫu xử lí 30 phút. Về mặt khối lượng, sau khi xử lí kiềm trong 60 phút, khối lượng màng lọc giảm gần 5,5% so với mẫu ban đầu. Khi tiếp tục xử lí kiềm thêm 75 phút, khối lượng màng lọc giảm thêm 23% so với mẫu xử lí trong 60 phút. Điều này đúng với các kết quả của Nguyen et al., (2019) về tỉ lệ hao hụt khối lượng sau khi ngâm màng lọc PET trong dung dịch kiềm. Mức độ tổn thương của sợi polyethylene terephthalate của mẫu đối chứng và mẫu xử lí kiềm 60 phút sẽ được đánh giá qua hình chụp SEM sợi màng. y = 0.2604x - 7.2901 R² = 0.9908 0 5 10 15 20 25 30 35 0 30 60 90 120 150 T ỉ lệ h ao h ụ t hối lượng (% ) Thời gian (phút)
31
Hình 3. 2. Hình chụp SEM của sợi PET trước (A) và sau khi xử lí kiềm trong 60 phút (B)
Kết quả trên cho thấy sự khác nhau về cấu trúc bề mặt sợi PET giữa 2 mẫu. Sợi PET của mẫu đối chứng có bề mặt trơn láng, trong khi đối với mẫu đã xử lí 60 phút, bề mặt sợi màng xuất hiện rất nhiều vết xước (vòng tròn màu vàng) và có xu hướng lõm xuống (mũi tên màu trắng). Nguyên nhân của hiện tượng trên là do phản ứng thuỷ phân liên kết ester trong môi trường kiềm khiến cho sợi PET bị cắt mạch theo phương trình (3.1).
(3.1)
Hình 3. 3. Phản ứng thuỷ phân liên kết ester của sợi PET bằng KOH (Al-Sabagh et al., 2016)
Khoảng trống hay các vết trầy xước sẽ được tạo ra khi có quá nhiều mạch phân tử bị cắt đứt trên bề mặt sợi PET. Bên cạnh đó, một vài sợi PET bị cắt mạch có thể tạo thành các đoạn polymer lơ lửng tự do trong môi trường. Đây cũng là nguyên nhân chính khiến cho khối lượng màng PET bị giảm khi tăng thời gian ngâm kiềm.
Từ các dữ liệu trên, có thể kết luận thời gian ngâm màng PET trong dung dịch kiềm càng lâu, tỉ lệ hao hụt khối lượng càng lớn và cấu trúc màng càng yếu. Theo đó, thời gian ngâm kiềm 60 phút được lựa chọn để giảm thiểu tổn thất cơ học do dung dịch kiềm gây ra.
32
3.2.Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến hàm lượng đồng bám lên PET
Kết quả cho thấy lượng nano đồng bám lên màng PET có xu hướng tăng tương ứng với việc tăng nồng độ CuSO4 ban đầu và bão hoà ở các giá trị lớn hơn nồng độ 1M.
Hình 3. 4. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến lượng đồng bám lên màng PET
Nồng độ CuSO4 ban đầu được thay đổi với các giá trị dao động trong khoảng từ 0,4 – 1M. Thông qua việc thay đổi nồng độ CuSO4 ban đầu, hàm lượng nano đồng bám được lên màng sẽ khác nhau, tương ứng với khả năng kháng khuẩn của từng mẫu. Mẫu CuSO4_1,0 có hàm lượng nano đồng bám lên sợi màng cao nhất (≈ 2,086 mg/cm2), kết quả này cao hơn rất nhiều so với nghiên cứu của Chattopadhyay et al. (2014) chỉ đạt được 2,04×10-4 (mg/cm2). Các mẫu có nồng độ CuSO4 từ 1,2 – 1,4M không có sự khác biệt về mặt thống kê.
Hình 3. 5. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến màu sắc của màng PET
Kết quả màu sắc của các mẫu thay đổi từ màu xám sang đen tương ứng với sự tăng dần lượng nano đồng bám lên màng. Sự khác biệt về màu sắc có thể được giải thích dựa trên
y = -1,4228x2+ 3,9982x - 0,7061 R² = 0,9215 0.5 0.9 1.3 1.7 2.1 2.5 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Hàm lượng đ ồn g (m g/cm 2 )
33 2 nguyên nhân chính: sự tăng dần lượng đồng bám lên màng và mức độ bị oxi hoá của nano đồng khi tiếp xúc với không khí. Về mặt lý thuyết, khi tiếp xúc với không khí, các hạt nano đồng có xu hướng hình thành lớp oxide màu đen trên bề mặt (Ohiienko, 2018) và có xu hướng làm màu của mẫu đậm dần khi có càng nhiều hạt nano đồng bị oxi hoá. Gỉa thiết trên trùng khớp với kết quả về lượng nano đồng bám lên màng PET. Do đó, để tiết kiệm vật chất, mẫu CuSO4_1,0 sẽ được chọn để khảo sát khả năng kháng khuẩn.
Khả năng kháng khuẩn trên E. coli của các mẫu màng PET được khảo sát với các nồng độ CuSO4 ban đầu khác nhau. Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của mẫu có xu hướng tăng tuyến tính trong khoảng nồng độ CuSO4 từ 0,4 – 1,0M.
Hình 3. 6. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến khả năng kháng E. coli
Cụ thể hơn, sau 15 phút xử lí huyền phù vi sinh vật với mật độ đạt 102 (cfu/ml), hiệu suất kháng khuẩn cao nhất đạt được là 100% (giảm gần 2,6 log cfu/ml) tương ứng với mẫu CuSO4_1,0. Mẫu có hiệu suất thấp kháng khuẩn nhất là mẫu CuSO4_0,4 (giảm gần 1 log cfu/ml). Mẫu CuSO4_1,0 được sử dụng để xử lí với huyền phù vi khuẩn có mật độ ban đầu cao hơn (≈ 104 cfu/ml), kết quả cho thấy hiệu suất kháng khuẩn trên E. coli đạt 98,9% (giảm gần 2 log cfu/ml). Xu hướng tăng tuyến tính trên đã được chứng minh là do lượng ion Cu2+ được giải phóng ra nhiều hơn khi lượng nano đồng bám trên màng lọc cao, các ion Cu2+ có