3.4.1.Cơ chế hình thành nano đồng và sự thay đổi màu sắc của màng PET
Qúa trình khử ion Cu2+ thành nano đồng kim loại Cu0 bắt đầu từ phản ứng tạo 2 nguyên tử hydro khi cho NaH2PO2 tác dụng với phân tử nước ở 100°C (Lee et al., 2008):
H2PO2‾ + H2O → H2PO3‾ + 2H (3.2) Hai nguyên tử hydro sẽ có xu hướng nhường electron cho các ion Cu2+ để tạo thành đồng kim loại Cu0. Qúa trình này sẽ diễn ra dưới điều kiện nhiệt độ sôi 100°C theo phản ứng sau:
Cu2+ +2e → Cu0 (3.3)
Hình 3. 10. Màu sắc các mẫu màng PET theo thời gian phản ứng tương ứng với mẫu 10 phút (t10), mẫu 20 phút (t20) và mẫu 45 phút (t45)
Tuy nhiên, phương trình (3.3) có thể xảy ra một cách lần lượt. Theo đó, giai đoạn đầu, ion Cu2+ sẽ bị khử thành Cu+ trước, sau đó tiếp tục bị khử thành Cu0 (Menamo et al., 2017); (Ong et al., 2014). Tác giả trên cũng đề cập đến sự thay đổi màu sắc của dung dịch nano đồng theo thời gian phản ứng. Cụ thể hơn, ở giai đoạn đầu, dung dịch nano sẽ chuyển từ màu xanh dương sang màu vàng sậm báo hiệu sự hình thành của Cu+ (Cu2O). Qúa trình trên diễn ra trong vòng 10 phút tính từ thời điểm thêm TEA vào dung dịch. Đối với giai đoạn sau, dung dịch nano chuyển từ màu vàng sậm sang màu đỏ gạch báo hiệu sự hình thành Cu0
trong vòng 35 phút sau khi kết thúc giai đoạn 1. Một cách tổng quát, phương trình phản ứng của cả 2 giai đoạn được rút gọn như sau:
Cu+2 + H2PO2 –
+ H2O → Cu0 + H2PO3 – + 2H+ (3.4) Triethanolamine (TEA) về bản chất là một phân tử amine bậc 3 chứa 3 nhóm hydroxyl. Sau khi thêm TEA vào dung dịch nano đồng chứa màng lọc PET, các gốc hydroxyl (OH) sẽ tấn công vào liên kết ester trong chuỗi polymer của màng lọc, làm đứt mạch phân tử và tạo môi trường kiềm trong dung dịch. Các nhóm hydroxyl còn lại sẽ tấn công vào các
38 liên kết ester khác trên sợi PET và nối các đoạn oligomers khác lại với nhau để hình thành 1 mạng lưới (Hình 3.11).
Hình 3. 11. Cơ chế tác động của TEA lên màng lọc PET (Rezaie & Montazer, 2017)
39 Trong suốt quá trình trên, các hạt nhân nano đồng (nucleic) sẽ bắt đầu đính lên các lỗ hổng tạo ra nhờ quá trình xử lí kiềm và tác động của TEA lên màng lọc PET. Dưới điều kiện nhiệt độ sôi, nhiều phần tử nano đồng sẽ được hình thành theo thời gian và bám vào các hạt nhân đã có trước đó, dẫn đến hiện tượng tăng kích thước của hạt. Chất bao có vai trò liên kết với nano đồng kim loại để ngăn cản sự keo tụ và giữ cho kích thước hạt nano ổn định trong suốt giai đoạn gia tăng kích thước hạt (Rezaie & Montazer, 2017).
Tuy nhiên, hạt nano đồng kim loại rất dễ bị oxi hoá để hình thành một lớp đồng oxide (CuO) trên bề mặt ngay khi tiếp xúc với oxi theo phản ứng sau (Ohiienko, 2018) :
2Cu0 + O2 → 2CuO (3.5)
Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể về màu giữa mẫu t10 và 2 mẫu t20, t45. Trong đó, mẫu t20 và t45 gần như không có sự khác biệt về màu sắc. Theo Ong et al. (2014), mẫu t10 xuất hiện màu vàng chứng tỏ có sự có mặt của Cu2O nano bám trên màng PET. Các mẫu còn lại (t20 và t45) đều đã bị khử thành Cu0 kim loại đồng thời hình thành 1 lớp oxide màu đen (CuO) trên bề mặt.
Để kiểm chứng nhận định trên, Cu/Cu2O trên màng được định tính bằng cách ngâm mẫu t10, t20 và t45 vào 10 ml dung dịch acid HCl 0,1M. Kết quả cho thấy chỉ có duy nhất mẫu t10 bị mất màu, các mẫu còn lại đều xuất hiện màu đỏ trên màng. Đối với các mẫu t20 và t45, lớp đồng (II) oxide bên ngoài sẽ phản ứng với acid loãng làm mất màu đen của màng PET, đồng thời để lộ màu đỏ gạch của lõi nano đồng kim loại bên trong. Đối với mẫu t10 với thành phần chủ yếu là đồng (I) oxide, lượng đồng này sẽ phản ứng hết với acid HCl loãng gây ra hiện tượng mất màu vàng của màng PET. Tất cả kết quả trên chứng tỏ thành phần nano của mẫu t10 chủ yếu là Cu2O và mẫu t20, t45 là đồng kim loại (Cu) với một lớp đồng (II) oxide mỏng bám trên bề mặt.
Hình 3. 13. Kết quả định tính Cu2O của 3 mẫu màng t10, t20 và t45 sau khi ngâm với acid
40
3.4.2.Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến khả năng kháng Escherichia coli
Kết quả cho thấy khả năng kháng khuẩn của mẫu t10 cao hơn so với mẫu t45. Cụ thể, mẫu t10 có hiệu suất kháng khuẩn đối với dịch vi khuẩn E. coli (mật độ ban đầu đạt 104 cfu/ml) là 99,98%, giảm được gần 4 log (cfu/ml) vi khuẩn. Trong khi đó mẫu t45 chỉ giảm được gần 3 log (cfu/ml) vi khuẩn với cùng điều kiện. Không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa mẫu t10 và t20. Kết quả trên cao hơn so với nghiên cứu của Razeeb, K. M. et al. (2014) khi họ chỉ giảm được 1,67 log (cfu/ml) vi khuẩn E. coli sau 6 giờ tiếp xúc (mật độ ban đầu đạt 3,9 cfu/ml). Trong khi đó, nghiên cứu của chúng tôi có thể tiêu diệt gần 4 log (cfu/ml) vi khuẩn chỉ trong 15 phút tiếp xúc.
Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến khả năng kháng E. coli của nano đồng
Mẫu Log red (cfu/ml) Hiệu suất kháng khuẩn (%)
t10 3,90 ± 0,27a 99,99 ± 0,01a t20 3,93 ± 0,14b 99,99 ± 0,00a
t45 3,04 ± 0,09b 99,91 ± 0,02b
*Các giá trị (a-b) trong cùng một hàng khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Hình 3. 14. Khả năng kháng E. coli của mẫu t10, với: A – mật độ vi khuẩn trước xử lí; B – mật độ vi khuẩn sau khi xử lí với mẫu t10
Sự khác biệt về khả năng kháng khuẩn chủ yếu do khả năng kháng khuẩn của đồng (I) oxide (Cu2O) mạnh hơn so với CuO (Meghana, S. et al. 2015). Cấu trúc hạt nano của các mẫu t20 và t45 đều bị bao bọc bởi lớp CuO mỏng hình thành do nano đồng kim loại bị oxi hoá ngay khi tiếp xúc với không khí. Khả năng giải phóng đồng của 2 mẫu trên sẽ bị cản trở và kém hơn so với mẫu t10 có thành phần chủ yếu là nano Cu2O. Điều này đúng với nghiên cứu của Hans et al. (2013) khi họ cũng chứng minh rằng tỉ lệ giải phóng đồng của nano CuO
41 kém hơn so với Cu2O. Một giả thuyết khác đề ra bởi Mittapally et al. (2018) khẳng định rằng khả năng kháng khuẩn của đồng oxide phụ thuộc vào chỉ số pKS[MeO/Me(OH)] hay tính tan của chúng trong dung dịch để có thể dễ dàng tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Theo đó, AgO và Cu2O là 2 oxide kim loại có tính tan cao nhất, với giá trị pKS tương ứng là – 7,7 và – 9, cao hơn so với CuO và các oxide kim loại khác. Khả năng giải phóng ion cao, tính tan tốt và khả năng tương tác với protein (Meghana et al., 2015) là cơ sở để nano Cu2O có thể tiếp xúc với tế bào vi khuẩn, từ đó làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, tương tác với protein, DNA và bất hoạt các enzyme khiến tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt (Mittapally et al., 2018).
Hình 3. 15. Khả năng kháng E. coli của mẫu t10 và mẫu t45
Từ những kết quả trên, có thể thấy khả năng kháng khuẩn của màng PET – nano đồng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như kích thước, bản chất, lượng hạt nano bám trên màng và khả năng giải phóng ion đồng của hạt nano. Mặc dù có kích thước hạt trung bình không khác biệt có ý nghĩa nhưng mẫu t10 lại kháng khuẩn tốt hơn các mẫu t20 và t45. Do đó, mẫu t10 được chọn làm mẫu tối ưu trong thí nghiệm trên.
3.4.3.Khả năng kháng Staphylococcus aureus của màng PET – nano Cu2O
Khả năng kháng Staphylococcus aureus được đánh giá bằng phương pháp trải đĩa và đếm khuẩn lạc còn sống sót, sử dụng mẫu t10 làm đối tượng khảo sát. Kết quả cho thấy khi bơm huyền phù vi khuẩn có mật độ ban đầu đạt 104 (cfu/ml) qua màng lọc PET (t10) được giữ bằng khung lọc (holder), S. aureus bị tiêu diệt hoàn toàn. Cụ thể, khả năng kháng S.
aureus cao hơn so với kết quả kháng E. coli (giảm 4,65 log cfu/ml và 4 log cfu/ml, tương
ứng) khi khảo sát trên cùng mẫu t10.
y = -0,0011x2+ 0,0359x + 3,648 R² = 1 2.7 3.2 3.7 4.2 0 10 20 30 40 50 L o g re d ( cf u/m l) Thời gian phản ứng (phút)
42
Hình 3. 16. Khả năng kháng Staphylococcus aureus của mẫu t10
Kết quả trên đồng thuận với kết quả của Sedighi et al. (2014) khi họ cũng chứng minh nano Cu2O có khả năng kháng S. aureus mạnh hơn so với E. coli. Nghiên cứu trước đó của Emami-Karvani et al. (2011) cũng khẳng định khả năng kháng khuẩn của nano kim loại trên vi khuẩn Gram – dương mạnh hơn so với vi khuẩn Gram – âm. Điều này có thể được giải thích dựa trên cấu tạo thành tế bào và kích thước của vi khuẩn (Li et al., 2015). Theo đó, thành tế bào của S. aureus không có lớp màng ngoài (outer membrane) và có lớp màng peptidoglycan dày (20 – 80 nm) chứa các gốc teichoic acid tích điện âm, khiến cho S.
aureus có ái lực với các ion và nano đồng cao hơn so với E. coli. Đối với thành tế bào của
E. coli, sự có mặt của các kênh porins nhỏ ở màng ngoài (outer membrane) ngăn cản sự xâm
nhập của hạt nano đồng hiệu quả hơn so với S. aureus. Cuối cùng, kích thước tế bào nhỏ của
S. aureus (d ≈ 0,5 – 1,0 μm) sẽ làm tăng diện tích và khả năng tiếp xúc trực tiếp với hạt nano
đồng so với E. coli (≈ 1,0 – 6,0 μm) (Li et al., 2015).
Tất cả kết quả trên cho thấy khả năng kháng S. aureus của màng PET – nano Cu2O (mẫu t10) có hiệu quả vượt trội hơn so với khả năng kháng E. coli của cùng mẫu.
3.5.Hình thái, kích thước và phân bố hạt nano đồng trên màng lọc
Hình thái, kích thước và sự phân bố hạt nano đồng của mẫu t10 và t45 được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Kết quả cho thấy gần như tất cả hạt nano trong các mẫu đều có hình cầu, với kích thước của các hạt nano đồng trên mẫu t10 dao động trong khoảng từ 50 – 600 nm. Điều này phù hợp với định nghĩa của Mohanraj et al. (2006) khi họ khẳng định rằng vật liệu có kích thước từ 1,0 nm – 1,0 μm đều được xem là vật liệu có kích thước nano.
Cụ thể, mẫu t10 có đường kính hạt chủ yếu nằm trong khoảng 150 – 300 nm, chiếm 72,6% tổng số hạt đo được. Trong số các hạt trên, các hạt có kích thước 200 – 250 chiếm
43 chủ yếu (49,6%). Trong khi đó, mẫu t45 có đường kính hạt phân bố đều, chủ yếu đạt từ 100 – 300 nm, chiếm 74,3% tổng số hạt đo được. Về mặt thống kê, đường kính trung bình của hạt nano giữa 2 mẫu không có sự khác biệt đáng kể. Kết quả trên cao hơn so với kích thước hạt nano đồng trung bình của Rezaie và Montazer (2017) chỉ đạt 80,37 nm. Tuy nhiên, xét về mặt phân bố, mẫu t45 có nhiều hạt có kích thước nhỏ và phân bố đều hơn so với mẫu t10. Hiện tượng trên có thể do các hạt ở mẫu t10 kết tụ với nhau nhiều hơn so với mẫu t45 dẫn đến việc hạt mẫu t10 lớn hơn.
Hình 3. 17. Hình thái hạt nano đồng trên mẫu t10 và mẫu t45
Kết quả hình chụp SEM cho thấy xu hướng phân bố của hạt nano ở mẫu t10 là kết tụ thành cụm, trong khi ở mẫu t45 lại ít gặp hiện tượng trên. Các cụm hạt trên chủ yếu được cấu tạo từ các hạt nano nhỏ hơn (Dankovich et al., 2014). Nhìn chung, thời gian phản ứng có ảnh hưởng đến kích thước hạt nano đồng. Đối với mẫu t10, thời gian phản ứng ít dẫn đến việc chất bao chưa đủ thời gian để bao bọc hạt nano hiệu quả. Khi dừng phản ứng và lấy
t10
t10
t45
44 màng lọc ra rửa, các phần tử chất bao có thể bị rửa trôi dẫn đến việc hiệu quả chất bao giảm, các hạt nano sẽ có xu hướng kết tụ trở lại và hình thành các cụm hạt lớn.
0 20 40 60 80 100 0 100 200 300 400 500 600 700 0 20 40 60 Số hạt tích luỹ ( hạt) Kích thước hạt (nm)
Phần trăm xuất hiện (%
) Trung bình = 240,52 nm SD = 79,09 Tổng số hạt đếm = 150 t10 0 20 40 60 80 100 0 100 200 300 400 500 600 700 0 5 10 15 20 25 30 35 Số hạt tích luỹ ( hạt) Kích thước hạt (nm) Trung bình = 221,05 nm SD = 92,10 Tổng số hạt đếm = 152 t45
Phần trăm xuất hiện (%
)
Hình 3. 18. Biểu đồ kích thước và phân bố hạt của mẫu t10 và mẫu t45
Một nguyên nhân khác có thể do màng lọc PET đã bị ngâm trong dung dịch KOH 10M trước khi tổng hợp nano đồng lên màng lọc. Qúa trình thuỷ phân mạch polymer của màng PET sẽ hình thành những “vết sẹo” lõm xuống trên bề mặt sợi vải (vòng tròn đỏ), từ đó dẫn đến việc lượng đồng bám lên các “vết sẹo” sẽ tăng nhờ liên kết tĩnh điện với các gốc COO‾ tại bề mặt vết lõm. Xu hướng này đúng với các nghiên cứu trước đó của Nguyen et al. (2019) về sự tương tác giữa ion và kim loại đồng với sợi PET bị thuỷ phân bằng kiềm.
45
Bảng 3. 4. Phân bố phần trăm nguyên tố trên mẫu t10 và t45
Mẫu t10 Mẫu t45
Element Weight% Atomic% Weight% Atomic%
C K 29,94 45,17 66,61 56,15
O K 41,12 46,58 31,48 35,35
Co K 0,00 0,00 0,00 0,01
Cu L 28,94 8,25 1,91 8,50
Totals 100,00
Hình 3. 19. Phổ EDX màng lọc PET – nano đồng của mẫu t10 và t45
Sự có mặt của hạt nano đồng được xác nhận thông qua phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX). Kết quả cho thấy cả 2 mẫu t10 và t45 đều có các đỉnh peak của nguyên tố đồng và nguyên tố oxi. Điều này củng cố cho giả thiết về việc nano đồng tổng hợp trên màng lọc PET là hỗn hợp của đồng kim loại (Cu) và đồng oxide (CuO hoặc Cu2O). Trong trường hợp này, cấu trúc hạt gồm đồng (I) oxide đối với mẫu t10 và cấu trúc hạt gồm đồng kim loại – lớp vỏ đồng (II) oxide đối với mẫu t45. Kết quả phần trăm nguyên tố oxi của mẫu t45 thấp hơn so với mẫu t10 đúng với sự chuyển đổi (phản ứng khử CuSO4) theo thứ tự từ CuSO4 – Cu2O – CuO. Ngoài ra, lượng CuO bám trên bề mặt hạt nano đồng ở mẫu t45 rất thấp và phù hợp với kết quả màu của màng PET (Hình 3.13).
46
3.6.Hình thái tế bào vi khuẩn sau khi bị xử lí qua màng lọc PET gắn nano đồng
Hình thái, cấu trúc tế bào bị tổn thương và sự có mặt của hạt nano đồng trên tế bào
E. coli được đánh giá thông qua phổ EDX và hình chụp SEM tế bào vi khuẩn. Dịch huyền
phù vi khuẩn có mật độ ban đầu đạt 104 cfu/ml sẽ được bơm qua màng lọc PET (mẫu t10) trong 15 phút để thu dịch lọc để tiến hành chuẩn bị mẫu (Mục 2.2.7).
Hình 3. 20. Hình thái của tế bào E. coli trước (A, B) và sau khi bị lọc qua màng PET – nano đồng (C, D)
Kết quả phổ EDX cho thấy không có dấu hiệu của nguyên tố đồng (Cu) trên tế bào vi khuẩn. Điều này chứng tỏ các ion đồng dư lượng trong dịch vi khuẩn sau khi lọc có thể đã bị rửa trôi trong quá trình chuẩn bị mẫu (công đoạn rửa cồn). Kết quả hình chụp SEM cho thấy bề mặt tế bào E. coli sau khi bị lọc qua màng lọc PET – nano đồng (C, D) có hiện tượng bị co rút (vòng tròn màu vàng) và bị vỡ hoàn toàn tế bào (vòng tròn màu trắng). Các tế bào
E. coli trước khi xử lí không xuất hiện tổn thương trên thành tế bào. Do đó, có thể kết luận
những tổn thương xuất hiện ở tế bào (C, D) chủ yếu do ảnh hưởng của nano đồng gây ra.
A
C
B
47 Hiện tượng bề mặt tế bào bị biến dạng hoặc bị phá vỡ do ảnh hưởng của nano kim loại được các kết quả nghiên cứu của Halbus et al. (2019); He et al. (2016) và Li et al. (2016) ủng hộ.
Nguyên nhân của sự co rút sau khi xử lí với nano đồng được giải thích dựa trên khả năng làm thay đổi tính thấm của thành tế bào vi khuẩn. Cụ thể, khi tế bào E. coli tiếp xúc với hạt nano đồng, các ion đồng sẽ đi xuyên qua các kênh dẫn và làm thay đổi tính thấm của