Sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê giữa các điều kiện thí nghiệm được xử lý ANOVA bằng phần mềm SPSS (Version 20.0, SPSS, Chicago, IL, USA) và Excel 2013.
30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của thời gian xử lý kiềm đến khối lượng của màng lọc
Thời gian xử lí kiềm là một trong các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đính nano đồng lên bề mặt sợi PET. Cơ chế của hiện tượng trên có thể được giải thích thông qua phản ứng thuỷ phân liên kết ester của sợi PET bằng dung dịch kiềm KOH 10M, tạo ra các rãnh chứa các gốc COO‾ có khả năng giữ hạt nano kim loại. Để kiểm chứng giả thiết trên, tỉ lệ hao hụt khối lượng của màng lọc PET khi ngâm trong dung dịch kiềm được tiến hành khảo sát với các khoảng thời gian khác nhau.
Hình 3. 1. Tỉ lệ hao hụt khối lượng màng lọc PET khi xử lí kiềm
Kết quả cho thấy tỉ lệ hao hụt khối lượng tăng đáng kể khi tăng thời gian ngâm trong dung dịch kiềm của các màng PET. Về mặt ngoại quan, cấu trúc của màng lọc PET có xu hướng yếu đi khi tăng thời gian xử lí kiềm. Đối với mẫu ngâm kiềm trong 135 phút, cấu trúc màng rất yếu và dễ dàng bị kéo rách so với mẫu xử lí 30 phút. Về mặt khối lượng, sau khi xử lí kiềm trong 60 phút, khối lượng màng lọc giảm gần 5,5% so với mẫu ban đầu. Khi tiếp tục xử lí kiềm thêm 75 phút, khối lượng màng lọc giảm thêm 23% so với mẫu xử lí trong 60 phút. Điều này đúng với các kết quả của Nguyen et al., (2019) về tỉ lệ hao hụt khối lượng sau khi ngâm màng lọc PET trong dung dịch kiềm. Mức độ tổn thương của sợi polyethylene terephthalate của mẫu đối chứng và mẫu xử lí kiềm 60 phút sẽ được đánh giá qua hình chụp SEM sợi màng. y = 0.2604x - 7.2901 R² = 0.9908 0 5 10 15 20 25 30 35 0 30 60 90 120 150 T ỉ lệ h ao h ụ t hối lượng (% ) Thời gian (phút)
31
Hình 3. 2. Hình chụp SEM của sợi PET trước (A) và sau khi xử lí kiềm trong 60 phút (B)
Kết quả trên cho thấy sự khác nhau về cấu trúc bề mặt sợi PET giữa 2 mẫu. Sợi PET của mẫu đối chứng có bề mặt trơn láng, trong khi đối với mẫu đã xử lí 60 phút, bề mặt sợi màng xuất hiện rất nhiều vết xước (vòng tròn màu vàng) và có xu hướng lõm xuống (mũi tên màu trắng). Nguyên nhân của hiện tượng trên là do phản ứng thuỷ phân liên kết ester trong môi trường kiềm khiến cho sợi PET bị cắt mạch theo phương trình (3.1).
(3.1)
Hình 3. 3. Phản ứng thuỷ phân liên kết ester của sợi PET bằng KOH (Al-Sabagh et al., 2016)
Khoảng trống hay các vết trầy xước sẽ được tạo ra khi có quá nhiều mạch phân tử bị cắt đứt trên bề mặt sợi PET. Bên cạnh đó, một vài sợi PET bị cắt mạch có thể tạo thành các đoạn polymer lơ lửng tự do trong môi trường. Đây cũng là nguyên nhân chính khiến cho khối lượng màng PET bị giảm khi tăng thời gian ngâm kiềm.
Từ các dữ liệu trên, có thể kết luận thời gian ngâm màng PET trong dung dịch kiềm càng lâu, tỉ lệ hao hụt khối lượng càng lớn và cấu trúc màng càng yếu. Theo đó, thời gian ngâm kiềm 60 phút được lựa chọn để giảm thiểu tổn thất cơ học do dung dịch kiềm gây ra.
32
3.2.Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến hàm lượng đồng bám lên PET
Kết quả cho thấy lượng nano đồng bám lên màng PET có xu hướng tăng tương ứng với việc tăng nồng độ CuSO4 ban đầu và bão hoà ở các giá trị lớn hơn nồng độ 1M.
Hình 3. 4. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến lượng đồng bám lên màng PET
Nồng độ CuSO4 ban đầu được thay đổi với các giá trị dao động trong khoảng từ 0,4 – 1M. Thông qua việc thay đổi nồng độ CuSO4 ban đầu, hàm lượng nano đồng bám được lên màng sẽ khác nhau, tương ứng với khả năng kháng khuẩn của từng mẫu. Mẫu CuSO4_1,0 có hàm lượng nano đồng bám lên sợi màng cao nhất (≈ 2,086 mg/cm2), kết quả này cao hơn rất nhiều so với nghiên cứu của Chattopadhyay et al. (2014) chỉ đạt được 2,04×10-4 (mg/cm2). Các mẫu có nồng độ CuSO4 từ 1,2 – 1,4M không có sự khác biệt về mặt thống kê.
Hình 3. 5. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến màu sắc của màng PET
Kết quả màu sắc của các mẫu thay đổi từ màu xám sang đen tương ứng với sự tăng dần lượng nano đồng bám lên màng. Sự khác biệt về màu sắc có thể được giải thích dựa trên
y = -1,4228x2+ 3,9982x - 0,7061 R² = 0,9215 0.5 0.9 1.3 1.7 2.1 2.5 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Hàm lượng đ ồn g (m g/cm 2 )
33 2 nguyên nhân chính: sự tăng dần lượng đồng bám lên màng và mức độ bị oxi hoá của nano đồng khi tiếp xúc với không khí. Về mặt lý thuyết, khi tiếp xúc với không khí, các hạt nano đồng có xu hướng hình thành lớp oxide màu đen trên bề mặt (Ohiienko, 2018) và có xu hướng làm màu của mẫu đậm dần khi có càng nhiều hạt nano đồng bị oxi hoá. Gỉa thiết trên trùng khớp với kết quả về lượng nano đồng bám lên màng PET. Do đó, để tiết kiệm vật chất, mẫu CuSO4_1,0 sẽ được chọn để khảo sát khả năng kháng khuẩn.
Khả năng kháng khuẩn trên E. coli của các mẫu màng PET được khảo sát với các nồng độ CuSO4 ban đầu khác nhau. Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của mẫu có xu hướng tăng tuyến tính trong khoảng nồng độ CuSO4 từ 0,4 – 1,0M.
Hình 3. 6. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 ban đầu đến khả năng kháng E. coli
Cụ thể hơn, sau 15 phút xử lí huyền phù vi sinh vật với mật độ đạt 102 (cfu/ml), hiệu suất kháng khuẩn cao nhất đạt được là 100% (giảm gần 2,6 log cfu/ml) tương ứng với mẫu CuSO4_1,0. Mẫu có hiệu suất thấp kháng khuẩn nhất là mẫu CuSO4_0,4 (giảm gần 1 log cfu/ml). Mẫu CuSO4_1,0 được sử dụng để xử lí với huyền phù vi khuẩn có mật độ ban đầu cao hơn (≈ 104 cfu/ml), kết quả cho thấy hiệu suất kháng khuẩn trên E. coli đạt 98,9% (giảm gần 2 log cfu/ml). Xu hướng tăng tuyến tính trên đã được chứng minh là do lượng ion Cu2+ được giải phóng ra nhiều hơn khi lượng nano đồng bám trên màng lọc cao, các ion Cu2+ có khả năng liên kết và làm thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn, đồng thời xâm nhập qua các kênh dẫn và tác động tiêu cực lên cấu trúc DNA của vi khuẩn, can thiệp vào quá
y = 2,8282x - 0,5043 R² = 0,9324 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 L og r ed (c fu /m l) Nồng độ CuSO4(M)
34 trình nguyên phân, cuối cùng là bất hoạt và tiêu diệt vi khuẩn (Lemire, Harrison, & Turner, 2013). Từ những dữ liệu trên, mẫu CuSO4_1,0 có khả năng kháng khuẩn tối đa là 98,9% ứng với mật độ vi khuẩn ban đầu đạt 104 (cfu/ml) sẽ được xem là mẫu tốt nhất.
Bảng 3. 1. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến khả năng kháng E. coli của nano đồng
Mẫu Log red (cfu/ml) Hiệu suất kháng khuẩn (%)
CuSO4_0,4 0,80 ± 0,35a 95,99 ± 1,16a CuSO4_0,6 1,03 ± 0,13a 90,36 ± 2,58b CuSO4_0,8 1,58 ± 0,10b 97,34 ± 0,61a CuSO4_1,0 2,30 ± 0,37c 99,77 ± 0,01c
*Các giá trị (a-c) trong cùng một hàng khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Hình 3. 7. Khả năng kháng E. coli của mẫu: A,B –mật độ vi khuẩn trước và sau xử lí với
mẫu CuSO4_0,4; C,D –mật độ vi khuẩn trước và sau xử lí với CuSO4_1,0
Bên cạnh đó, kích thước của một số khuẩn lạc có sự thay đổi khi tăng nồng độ CuSO4
ban đầu. Một số khuẩn lạc ở các mẫu CuSO4_0,4 và CuSO4_0,6 có đường kính nhỏ hơn so với phần lớn khuẩn lạc bình thường. Các khuẩn lạc bất thường này có đường kính xấp xỉ 0,5 mm, trong khi phần lớn các khuẩn lạc còn lại có đường kính đạt 3 mm. Hiện tượng trên được giải thích do tế bào vi khuẩn E. coli bị tổn thương nhưng chưa chết hẳn và cần thời gian phục hồi lâu hơn so với các tế bào vi khuẩn khác. Do đó tốc độ tăng kích thước của khuẩn lạc đó sẽ chậm hơn so với những khuẩn lạc bình thường.
Từ các dữ liệu trên có thể thấy khả năng kháng khuẩn trên E. coli của nano đồng tỉ lệ thuận với lượng nano đồng bám được lên màng lọc PET. Dựa vào nồng độ CuSO4 ban đầu và khả năng kháng E. coli, mẫu CuSO4_1,0 được lựa chọn làm mẫu tối ưu để tiếp tục các khảo sát sau.
35
3.3.Ảnh hưởng của hàm lượng chất bao đối với khả năng kháng khuẩn của màng
Từ kết quả trên, mẫu CuSO4_1,0 được chọn để tiếp tục khảo sát hàm lượng PVP. Kết quả cho thấy lượng đồng bám lên màng có xu hướng tăng khi tăng hàm lượng chất bao, đạt cực đại ở giá trị 1% PVP và bắt đầu giảm trong khoảng từ 1,2 – 1,4% PVP. Hàm lượng nano đồng cao nhất đạt được trong thí nghiệm này là xấp xỉ 3,13 (mg/cm2), cao hơn so với mẫu CuSO4_1,0 và cao hơn so với kết quả của Chattopadhyay (2014) chỉ đạt được 2,04×10-4 (mg/cm2). Các mẫu có hàm lượng PVP từ 1,0 – 1,2% không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Hình 3. 8. Ảnh hưởng của hàm lượng PVP đến lượng nano đồng trên màng lọc PET
Kết quả cho thấy việc tăng chất bao PVP sẽ làm tăng lượng đồng bám được lên màng đến một giới hạn nhất định. Điều này được giải thích dựa trên cơ chế bao bọc và cố định nano đồng của PVP. Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng chất bao quá cao, hạt nhân nano sau khi hình thành trong dung dịch có thể bị bao bọc ngay lập tức, khiến cho quá trình bám dính của hạt nano lên mạch polymer bị cản trở, từ đó làm giảm lượng nano đồng đính được lên màng lọc (Chen et al., 2010).
Xét về khả năng kháng khuẩn, hàm lượng PVP quá cao cũng sẽ cản trở quá trình giải phóng ion Cu2+ và làm giảm khả năng kháng khuẩn của màng. Điều này đúng với nghiên cứu của Chen et al. (2010) khi họ cũng kết luận PVP ở nồng độ 0,033 g/20 ml có thể cản trở quá trình giải phóng ion kim loại. Trên thực tế, mẫu có khả năng kháng khuẩn cao nhất (giảm gần 3,0 log) là mẫu PVP_0,8 tương ứng với lượng nano đồng đạt gần 3 (mg/cm2). Trong khi đó, mẫu có hàm lượng PVP và lượng đồng bám lên màng lọc cao hơn (PVP_1,0)
y = -5,6919x2+ 12,294x - 3,3447 R² = 0,9887 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Hàm lượng đ ồn g (m g/cm 2) Hàm lượng PVP (%w/v)
36 lại kháng khuẩn kém hơn (giảm gần 2,75 log cfu/ml). Điều này chứng minh rằng giả thiết về việc cản trở khả năng diệt khuẩn khi hàm lượng PVP quá cao là hoàn toàn có cơ sở.
Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của hàm lượng PVP đến khả năng kháng E. coli của nano đồng
Mẫu Log red (cfu/ml) Hiệu suất kháng khuẩn (%)
PVP_0,42 1,96 ± 0,09a 98,90 ± 0,22a PVP_0,8 3,04 ± 0,09b 99,91 ± 0,02b PVP_1,0 2,80 ± 0,12c 99,84 ± 0,05b
*Các giá trị (a-c) trong cùng một hàng khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Hình 3. 9.Ảnh hưởng của hàm lượng chất bao đến khả năng kháng E. coli của màng PET
Từ tất cả các dữ liệu trên cho thấy lượng nano đồng bám lên và khả năng kháng khuẩn của màng lọc có xu hướng tăng khi tăng hàm lượng chất bao (PVP) đến 0,8% (w/v). Theo đó, mẫu PVP_0,8 với thời gian xử lí kiềm trong 60 phút sẽ được xem là mẫu tối ưu trong thí nghiệm này.
y = -7,0052x2+ 11,387x - 1,584 R² = 1 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 L o g re d ( cf u/m l) Hàm lượng PVP (%)
37
3.4.Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến khả năng kháng khuẩn của màng PET 3.4.1.Cơ chế hình thành nano đồng và sự thay đổi màu sắc của màng PET 3.4.1.Cơ chế hình thành nano đồng và sự thay đổi màu sắc của màng PET
Qúa trình khử ion Cu2+ thành nano đồng kim loại Cu0 bắt đầu từ phản ứng tạo 2 nguyên tử hydro khi cho NaH2PO2 tác dụng với phân tử nước ở 100°C (Lee et al., 2008):
H2PO2‾ + H2O → H2PO3‾ + 2H (3.2) Hai nguyên tử hydro sẽ có xu hướng nhường electron cho các ion Cu2+ để tạo thành đồng kim loại Cu0. Qúa trình này sẽ diễn ra dưới điều kiện nhiệt độ sôi 100°C theo phản ứng sau:
Cu2+ +2e → Cu0 (3.3)
Hình 3. 10. Màu sắc các mẫu màng PET theo thời gian phản ứng tương ứng với mẫu 10 phút (t10), mẫu 20 phút (t20) và mẫu 45 phút (t45)
Tuy nhiên, phương trình (3.3) có thể xảy ra một cách lần lượt. Theo đó, giai đoạn đầu, ion Cu2+ sẽ bị khử thành Cu+ trước, sau đó tiếp tục bị khử thành Cu0 (Menamo et al., 2017); (Ong et al., 2014). Tác giả trên cũng đề cập đến sự thay đổi màu sắc của dung dịch nano đồng theo thời gian phản ứng. Cụ thể hơn, ở giai đoạn đầu, dung dịch nano sẽ chuyển từ màu xanh dương sang màu vàng sậm báo hiệu sự hình thành của Cu+ (Cu2O). Qúa trình trên diễn ra trong vòng 10 phút tính từ thời điểm thêm TEA vào dung dịch. Đối với giai đoạn sau, dung dịch nano chuyển từ màu vàng sậm sang màu đỏ gạch báo hiệu sự hình thành Cu0
trong vòng 35 phút sau khi kết thúc giai đoạn 1. Một cách tổng quát, phương trình phản ứng của cả 2 giai đoạn được rút gọn như sau:
Cu+2 + H2PO2 –
+ H2O → Cu0 + H2PO3 – + 2H+ (3.4) Triethanolamine (TEA) về bản chất là một phân tử amine bậc 3 chứa 3 nhóm hydroxyl. Sau khi thêm TEA vào dung dịch nano đồng chứa màng lọc PET, các gốc hydroxyl (OH) sẽ tấn công vào liên kết ester trong chuỗi polymer của màng lọc, làm đứt mạch phân tử và tạo môi trường kiềm trong dung dịch. Các nhóm hydroxyl còn lại sẽ tấn công vào các
38 liên kết ester khác trên sợi PET và nối các đoạn oligomers khác lại với nhau để hình thành 1 mạng lưới (Hình 3.11).
Hình 3. 11. Cơ chế tác động của TEA lên màng lọc PET (Rezaie & Montazer, 2017)
39 Trong suốt quá trình trên, các hạt nhân nano đồng (nucleic) sẽ bắt đầu đính lên các lỗ hổng tạo ra nhờ quá trình xử lí kiềm và tác động của TEA lên màng lọc PET. Dưới điều kiện nhiệt độ sôi, nhiều phần tử nano đồng sẽ được hình thành theo thời gian và bám vào các hạt nhân đã có trước đó, dẫn đến hiện tượng tăng kích thước của hạt. Chất bao có vai trò liên kết với nano đồng kim loại để ngăn cản sự keo tụ và giữ cho kích thước hạt nano ổn định trong suốt giai đoạn gia tăng kích thước hạt (Rezaie & Montazer, 2017).
Tuy nhiên, hạt nano đồng kim loại rất dễ bị oxi hoá để hình thành một lớp đồng oxide (CuO) trên bề mặt ngay khi tiếp xúc với oxi theo phản ứng sau (Ohiienko, 2018) :
2Cu0 + O2 → 2CuO (3.5)
Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể về màu giữa mẫu t10 và 2 mẫu t20, t45. Trong đó, mẫu t20 và t45 gần như không có sự khác biệt về màu sắc. Theo Ong et al. (2014), mẫu t10 xuất hiện màu vàng chứng tỏ có sự có mặt của Cu2O nano bám trên màng PET. Các mẫu còn lại (t20 và t45) đều đã bị khử thành Cu0 kim loại đồng thời hình thành 1 lớp oxide màu đen (CuO) trên bề mặt.
Để kiểm chứng nhận định trên, Cu/Cu2O trên màng được định tính bằng cách ngâm mẫu t10, t20 và t45 vào 10 ml dung dịch acid HCl 0,1M. Kết quả cho thấy chỉ có duy nhất mẫu t10 bị mất màu, các mẫu còn lại đều xuất hiện màu đỏ trên màng. Đối với các mẫu t20 và t45, lớp đồng (II) oxide bên ngoài sẽ phản ứng với acid loãng làm mất màu đen của màng PET, đồng thời để lộ màu đỏ gạch của lõi nano đồng kim loại bên trong. Đối với mẫu t10 với thành phần chủ yếu là đồng (I) oxide, lượng đồng này sẽ phản ứng hết với acid HCl loãng gây ra hiện tượng mất màu vàng của màng PET. Tất cả kết quả trên chứng tỏ thành phần nano của mẫu t10 chủ yếu là Cu2O và mẫu t20, t45 là đồng kim loại (Cu) với một lớp đồng (II) oxide mỏng bám trên bề mặt.
Hình 3. 13. Kết quả định tính Cu2O của 3 mẫu màng t10, t20 và t45 sau khi ngâm với acid