1.6.9.1.Bệnh béo phì
Trong những năm qua, béo phì đã đạt đến tỷ lệ trên toàn cầu. Nó được coi là một vấn đề sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới. Thừa cân là một yếu tố nguy cơ quan trọng đối với mãn tính bệnh không lây nhiễm như đái tháo đường, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và ung thư. Nó được gây ra bởi một số yếu tố, chẳng hạn như khuynh hướng di truyền, ăn uống không đầy đủ thói quen và lối sống ít vận động.
Béo phì, một tình trạng đặc trưng bởi lượng mỡ trong cơ thể quá mức, thường được cho là kết quả từ việc tiêu thụ quá nhiều chất béo. Chất béo dư thừa trong khẩu phần ăn hằng ngày là một trong những yếu tố môi trường quan trọng nhất dẫn đến tình trạng béo phì nó dẫn đến sự tích tụ mỡ quá mức trong cơ thể (Woo, 2008). Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) béo phì là kết quả của sự mất cân bằng năng lượng dẫn đến tích lũy chất béo, dẫn đến các biến chứng như tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, tăng triglyceride máu và tiểu đường (Fernandes, 2016).
Không dung nạp glucose, rối loạn lipid máu và tăng huyết áp là những biến chứng phổ biến của bệnh béo phì. Các nghiên cứu trước đây về tỷ lệ mắc bệnh béo phì đã chỉ ra rằng mức độ nghiêm trọng của các biến chứng không nhất thiết tương quan với mức độ của cơ thể tích tụ mỡ, nhưng liên quan chặt chẽ hơn đến phân phối mỡ cơ thể (Y Matsuzawa, 1999).
Vai trò chính của mô mỡ là nơi dự trữ chất béo trung tính triglyceride trong quá trình tiêu thụ năng lượng và sản sinh các acid béo khi năng lượng vượt quá năng lượng đầu vào. Mặc dù mô mỡ trắng được coi là một mô không hoạt động trao đổi chất, nhưng nó kiểm soát năng lượng của sự trao đổi chất (Gesta S, 2007). Quá trình này được thực hiện thông qua nội tiết, tín hiệu paracrine và autocrine cho phép các tế bào mỡ điều chỉnh sự trao đổi chất của các tế bào mỡ hoặc tế bào khác nằm ở não, gan, cơ hoặc tuyến tụy (Kim S, 2000).
Chức năng mô mỡ có thể được phân loại thành ba khía cạnh. Đầu tiên, nó liên quan đến quá trình chuyển hóa lipid bao gồm việc tích trữ triglyceride. Thứ hai, nó dị hóa các triglyceride theo thứ tự để giải phóng glycerol và acid béo tham gia chuyển hóa glucose ở gan và các mô khác. Cuối cùng, các tế bào mỡ tiết ra các adipokine, bao gồm hormone,
17
cytokine và các protein khác có chức năng sinh học cụ thể (Morrison RF F. S., 2000). Ngoài ra, các tế bào mỡ và mô mỡ tham gia tích cực vào quá trình trao đổi chất các quá trình như sự hình thành mạch, sự hình thành tế bào, chuyển hóa steroid, tăng miễn dịch và cầm máu (Bays HE, 2008), (Hedrich, 2004)
Hình 1.7. Các giai đoạn phát triển của tế bào mô mỡ (Guilherme, 2008).
Ở trạng thái a, các tế bào mỡ nhỏ lưu trữ hiệu quả các acid béo dưới dạng triglyceride (đầu vào TG, mũi tên), có thể được huy động và sử dụng để tạo ra ATP thông qua con đường oxy hóa ty thể trong cơ bắp trong thời gian cần calo. Glucose kích thích insulin hấp thu trong những điều kiện này là bình thường.
Ở trạng thái b, lượng calo dư thừa dẫn đến quá tải quá trình trao đổi chất thông thường, tăng lượng TG đi vào tế bào mỡ dẫn đến làm tăng cả kích thước và khối lượng tế bào mỡ so với bình thường.
Ở trạng thái c, lượng TG đi vào tế bào mỡ tăng quá tải dẫn đến phì đại tế bào mỡ và kích thích cơ chế tiết chất hóa học đại thực bào xảy ra, bao gồm cả sự bài tiết của bạch cầu đơn nhân protein hóa học-1 (MCP-1; mũi tên), làm tăng số lượng các đại thực bào trong tế bào mỡ.
Ở trạng thái d, mức độ xâm nhập của các thực bào quá mức dẫn đến tình trạng viêm trong mô mỡ bị béo phì. Các đại thực bào xâm nhập tiết ra một lượng lớn (TNF-α), dẫn đến tình trạng viêm mãn tính với sự lắng đọng TG. Sự dư thừa của TG tuần hoàn và
18
các acid béo tự do dẫn đến sự tích tụ lipid hoạt hóa trong cơ bắp (chấm màu vàng), phá vỡ các chức năng như phosphoryl oxy hóa ty thể và kích thích insulin vận chuyển glucose, do đó kích hoạt kháng insulin (Guilherme, 2008).
1.6.9.2.Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)
Bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD) là một thuật ngữ lâm sàng bao gồm một phổ bệnh từ tích lũy triglyceride đơn giản trong tế bào gan (gan nhiễm mỡ) đến gan nhiễm mỡ với viêm (viêm gan nhiễm mỡ), xơ gan. Quá trình này xảy ra khi sự hấp thu acid béo đặc biệt là các loại bão hòa và tổng hợp chúng vượt quá khả năng của các tế bào để oxy hóa hoặc tích trữ chúng dưới dạng các triglyceride (Kia M. Peters, 2018). Bệnh béo phì, tiểu đường loại 2, tăng huyết áp và tăng lipid máu có liên quan đến bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD) và có thể tiến triển thành xơ gan và đã được báo cáo là một trong những nguyên nhân gây ung thư tế bào gan (Yeh, 2007).
Hình 1. 8. Tiêu bản mô gan bình thường và mô gan nhiễm mỡ (giọt mỡ lớn-mũi tên)
(Alastair D. Burt, 2012)
Gan là cơ quan lớn nhất của cơ thể, chiếm từ 2 - 5% trọng lượng cơ thể trưởng thành, hoạt động như một người bảo vệ giữa đường tiêu hóa và phần còn lại của cơ thể, biến đổi, giải độc và tích lũy các chất chuyển hóa. Gan cũng tạo ra các loại protein huyết tương khác nhau, chẳng hạn như albumin, được đưa vào máu, cũng như các chất chuyển hóa là thành phần của mật (Arias IM, 1997). Tế bào gan (tế bào nhu mô) là thành phần cấu trúc cơ bản của gan, chiếm 60% tổng số tế bào và 80% tổng khối lượng gan. Chúng được sắp xếp một cách triệt để trong tiểu thùy để tạo thành các tấm tế bào, giữa đó là các mao mạch gan và các xoang gan (Braet, 2005 ).
19
Hình 1. 9. Hình ảnh mô phỏng gan bình thường và gan nhiễm mỡ
Một chức năng trao đổi chất trung tâm của gan là duy trì nồng độ glucose huyết tương bất kể trạng thái dinh dưỡng nào của động vật. Trong môi trường dư thừa năng lượng, glucose được chuyển đổi thành acid béo thông qua việc chuyển đổi glucose thành pyruvate, đi vào chu trình Krebs trong ty thể. Sau đó Citrate được chuyển thành acetyl- CoA, acetyl-CoA tiếp tục được chuyển thành malonyl-CoA, được sử dụng để tạo thành các acid béo nhờ các ezyme synthase. Các axit béo này được sử dụng để tổng hợp triglyceride - nguồn lưu trữ và vận chuyển năng lượng chính (Jeffrey D. Browning, 2004).
20
1.7.Các nghiên cứu trước đây
Ngày nay, do mức sống của con người ngày càng tăng cao nên nhu cầu cho những thức ăn nhanh cũng tăng theo. Do đó, lượng chất béo nạp vào cơ thể hàng ngày càng tăng cao và đó cũng là nguyên nhân chính dẫn đến một số bệnh liên quan đến chuyển hóa chất béo như bệnh béo phì, tiểu đường, gan nhiễm mỡ,… Việc giảm cân có thể được thực hiện thông qua chế độ ăn uống, đồng thời có thể kết hợp với một số bài tập, hoạt động thể thao và thay đổi lối sống giúp cải thiện quá trình trao đổi chất ở người béo phì nhưng đòi hỏi một quá trình lâu dài. Vì vậy, ngày nay một số nhà khoa học đã nghiên cứu khả năng ngăn ngừa bệnh béo phì từ các tinh bột trơ thông qua một số phương pháp biến đổi từ các loại tinh bột vốn được con người sử dụng làm lương thực chính trong bữa ăn hằng ngày trên động vật thí nghiệm.
1.7.1. Trong nước
Hiện nay, các thí nghiệm in vivo trên động vật ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế, chưa được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm, tuy nhiên gần đây có một số nghiên cứu trên động vật đang dần được thực hiện phổ biến hơn. Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu về “Tác dụng hạ đường huyết của một số loại thảo dược trên mô hình chuột in vivo”. Ngoài ra, “Mô hình bệnh tiểu đường biến chứng ở chuột cống trắng bằng khẩu phần ăn mỡ cao và tiêm Streptozotocin liều thấp” được Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện được đăng tải trên tạp chí sinh học (2013).
1.7.2. Ngoài nước
Trong nghiên cứu trước đây của (Higgins J. A., 2011) đề cập đến việc sử dụng tinh bột RS với hàm lượng cao trong việc giảm trọng lượng cơ thể đối với những con chuột có chế độ sử dụng chất béo cao trong khẩu phần ăn hàng ngày. Kết quả cho thấy tinh bột RS có ảnh hưởng đáng kể trong việc kiểm soát cân nặng.
Ngoài ra, Kwang Yeon Lee cùng các cộng sự đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của tinh bột trơ RS đến cân nặng cơ thể cũng như việc kiểm soát các chỉ số mỡ máu của 40 con chuột cái (C57BL/6J) trong vòng 6 tuần thí nghiệm. Kết quả cho thấy rằng với các nhóm bổ sung tinh bột RS4 có trọng lượng cơ thể giảm mạnh và tác dụng hạ lipid trong huyết thanh so với các nhóm tương ứng không sử dụng tinh bột RS4 (Kwang Yeon Lee, 2012).
21
Tương tự (Kim, 2003) đã tiến hành thử nghiệm trên 40 con chuột đực với các khẩu phần ăn khác nhau trong đó có khẩu phần ăn bổ sung tinh bột trơ từ ngô và gạo. Kết quả đã chứng minh rằng tinh bột trơ từ ngô hoặc gạo ở mức 16% (w /w) có tác dụng hạ đường huyết cũng như giảm nồng độ cholesterol, lipid trong máu ở chuột bị tiểu đường.
1.7.3. Lý do chọn đề tài
Hiện nay khi cuộc sống của con người trở nên bận rộn và hiện đại hơn trong công việc dẫn đến thời gian dành cho việc chuẩn bị một bữa ăn đầy đủ chất dinh dưỡng cũng như đảm bảo an toàn hầu như là hiếm khi. Do đó việc sử dụng các thức ăn nhanh là một trong những giải pháp của con người hiện nay, nên dẫn đến tình trạng béo phì cũng như các bệnh liên quan về chuyển hóa ngày càng trẻ hóa hơn trong độ tuổi. Đối với người Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng carbohydrate là nguồn cung cấp lương thực chính trong các khẩu phần ăn hằng ngày. Đối với những người bệnh béo phì gặp khó khăn trong quá trình giảm cân hay người bệnh tiểu đường cần hạn chế những thực phẩm có chỉ số đường huyết (GI) cao. Như chúng ta đã biết, bắp là một trong những loại cây lương thực phổ biến trên khắp thế giới và với sự sẵn có của nó nên được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Bên cạnh việc sử dụng tinh bột thô, người ta sử dụng nó như một loại phụ gia để cải thiện và ổn định cấu trúc của một số sản phẩm. Bằng cách tiến hành biến tính nguyên liệu thô bằng một số phương pháp vật lý hoặc hóa học để có được những đặc tính mong muốn như ổn định độ nhớt trong các loại sốt, làm chất mang trong thuốc, tăng hàm lượng tinh bột trơ so với nguyên liệu thô,… Vì vậy, chúng tôi chọn bắp sử dụng làm nguyên liệu cho đề tài nghiên cứu của chúng tôi.
Trong các công trình nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết trên động vật thí nghiệm ở Việt Nam hiện này còn hạn chế. Hầu như chưa có tác giả nào nghiên cứu về tác dụng giảm đường huyết, các chỉ số lipid máu cũng như kiểm soát cân nặng của tinh bột bắp bán thủy phân và ủ ở mô hình động vật thí nghiệm tính đến hiện nay. Vì vậy, chúng tôi quyết định xây dựng mô hình tiểu đường tuýp 2 thông qua việc gây béo phì bằng cách cho ăn khẩu phần ăn giàu béo ở chuột thí nghiệm. Cùng với việc kết hợp dụng tinh bột bắp đã được xử lý bằng acid kết hợp ủ nhằm đánh giá lợi ích của tinh bột này trong việc kiểm soát đường huyết cũng như cân nặng và một số các chỉ số khác liên quan đến quá trình chuyển hóa chất béo trong cơ thể.
22
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.Phương pháp bán thủy phân và ủ tinh bột bắp
Bảng 2.1. Bảng mã hóa các mẫu tinh bột
Tên mã hóa Mẫu
H0 Tinh bột bắp thô
H1 Tinh bột bắp thô được thủy phân 4 giờ
H5 Tinh bột bắp thô được thủy phân 14 giờ
H10 Tinh bột bắp thô được thủy phân 23 giờ
H15A Tinh bột bắp thô được thủy phân 30 giờ
H0A Tinh bột bắp thô kết hợp ủ 24 giờ
H1A Tinh bột bắp thô được thủy phân 4 giờ kết hợp ủ 24 giờ
H5A Tinh bột bắp thô được thủy phân 14 giờ kết hợp ủ 24 giờ
H10A Tinh bột bắp thô được thủy phân 23 giờ kết hợp ủ 24 giờ
H15A Tinh bột bắp thô được thủy phân 30 giờ kết hợp ủ 24 giờ
2.1.1.Phương pháp thủy phân
Tiến hành thủy phân mẫu tinh bột bắp thô (H0) ở các khoảng thời gian khác nhau 4 giờ (H1), 14 giờ (H5), 23 giờ (H10) và 30 giờ (H15) bằng dung dịch HCl (12,5 g H0/100 ml HCl 2,2 N) ở nhiệt độ phòng trong. Các mốc thời gian thủy phân được lựa chọn sao cho mức độ thủy phân của các mẫu lần lượt đạt mức thấp, trung bình, cao và rất cao. Các mẫu bột cần được lắc liên tục trong quá trình thủy phân bằng máy khuấy từ. Kết thúc quá trình thủy phân của các mẫu tinh bột H1, H5, H10, H15 bằng cách thêm NaOH 1,1 N cho đến khi dung dịch đạt pH 7,0. Sau đó, các mẫu này sẽ được ly tâm ở 1660 RCF trong 15 phút, các mẫu bột thu được sấy đối lưu ở nhiệt độ 40oC, nghiền và rây thành bột mịn.
2.1.2.Phương pháp ủ
Mẫu tinh bột bắp thô (H0) và các mẫu tinh bột bắp đã được thủy phân bằng acid (H1, H5, H10, H15) sẽ được huyền phù hóa bằng cách thêm nước cất để đạt nồng độ 30% (w/v) và ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 50oC (Brumovsky, 2001) và (Chung, 2009). Trong quá
23
trình ủ, các mẫu được lắc liên tục bằng máy lắc ổn nhiệt. Sau quá trình ủ, các mẫu trên được ly tâm ở 1660 RCF trong 15 phút. Các mẫu tinh bột thu được sau khi ly tâm (H0A, H1A, H5A, H10A, H15A) được sấy đối lưu ở nhiệt độ 40o
C, nghiền và rây thành bột mịn.
2.1.3.Phương pháp đo độ tiêu hóa in vitro
Độ tiêu hóa của tinh bột bắp được xác định dựa trên phương pháp của Englyst và cộng sự (1992), được sửa đổi bởi Sang và cộng sự (2007). Chuẩn bị dịch enzyme bằng cách cân pancreatin 2,0 g (Aladdin, China 350U/mg). Sau đó, hòa tan pancreatin trên vào 24 ml nước cất và khuấy bằng khuấy từ trong 15 phút. Dịch enzyme sau đó được ly tâm ở 1660 RCF trong 15 phút. Lấy 20 ml dịch nổi sau ly tâm pha với hỗn hợp gồm 3,6 ml nước cất và 0,4 ml amyloglucosidase. Đặt dịch enzyme này vào bể điều nhiệt ở 37oC trong 10 phút. Cân chính xác 0,1200 g mẫu tinh bột bằng cân 4 số, sau đó cho vào ống ly tâm (centrifuge tube) thể tích 15 ml. Cho 3,0 ml dung dịch đệm natri acetate (0,1 M; pH 5,2) vào ống ly tâm trên. Sau đó chuyển ống này vào bể điều nhiệt có nhiệt độ 370C trong 10 phút. Cho thêm 3,0 ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn vào và lắc liên tục trong bể điều nhiệt. Phản ứng thực hiện trong thời gian 10 và 240 phút với mẫu đã được hồ hóa 15 phút vả không hồ hóa. Enzyme được bất hoạt bằng cách đun sôi trong 15 phút và để nguội. Sau đó, dịch trong các ống ly tâm được ly tâm (Hettich Instruments – EBA 21, Tuttlingen, Đức) ở 1660 RCF trong 15 phút để thu lấy dịch nổi.
Xác định nồng độ glucose của dịch nổi thu được bằng phương pháp DNS thông qua đường chuẩn glucose. RDS và SDS được xác định dựa vào hàm lượng đường sinh ra sau 10 và 240 phút enzyme xúc tác thủy phân tinh bột. RS là phần còn lại không tiêu hóa sau 240 phút (Sang Ick Shina, 2007)
24