1.2.1. Enzyme Tyrosiase
Tyrosinase (EC 1.14.18.1), còn được gọi là polyphenoloxidase (PPO), là một loại enzyme cóchứa nguyên tử đồng được phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật, động vật và thực vật, đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành hắc sắc tố (Sanchez-Ferrer, Rodriguez-
15
Lopez, Garcia-Canovas, & Garcia- Carmona, 1995; Whitaker, 1995; Zawistowski, Biliaderis, & E Da, 1991).
Enzyme tyrosinase có thể tồn tại ở 3 dạng là: oxy, deoxy, met-tyrosinase. Cả dạng met- tyrosinase và dạng oxy-tyrosinase đều có hoạt tính diphenolase, trong khi chỉ có dạng oxy- tyrosinase là có hoạt tính monophenolase. Dạng deoxytyrosinase là dạng yếu, không ổn định; phản ứng với oxy để tạo thành dạng oxytyrosinase (Kim Y. J., Uyama H. (2005). Enzyme này có khả năng xúc tác hai phản ứng tổng hợp melanin khác nhau: một là quá trình hydroxyl hóa monophenol, hai là quá trình chuyển đổi o-diphenol thành o-quinone tương ứng (Robb, 1984).
1.2.2. Melanosis
Melanogenesis đã được định nghĩa là toàn bộ quá trình dẫn đến sự hình thành các hắc sắc tố đa phân tử được gọi là melanin. Melanosis là kết quả của quá trình trùng hợp các phenol bởi polyphenoloxidase (PPO), còn được gọi là phenoloxidase, tyrosinase (EC 1.14.18.1) và cathecoloxidase (EC 1.10.3.1) (Zamorano và cộng sự, 2009).
Mặc dù quá trình phát triển của melanosis không gây hại đến sức khoẻ người tiêu dùng nhưng lại gây ra các ảnh hưởng tiêu cực đến đặc tính thẩm mỹ cũng như giá trị thương mại một số loại động-thực vật (Gomez-Guill en, Martínez- Alvarez, Llamas, & Montero, 2005; Kim, Marshall, & Wei, 2000). Sự hình thành melanosis hoặc "đốm đen" là một vấn đề thường gặp ở động vật giáp xác trong quá trình bảo quản sau thu hoạch. Nó xảy ra do các phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi các enzym polyphenol oxidase (PPO), tạo ra các hắc sắc tố được gọi là melanin và tập trung chủ yếu dưới lớp vỏ của loài chân đốt (Nirmal & Benjakul, 2011a).
1.2.2.1. Cơ chế hình thành Melanosis
Con đường sinh tổng hợp hình thành nên melanin trong các sự sống khác nhau đã được làm rõ bởi công trình nghiên cứu Raper (1928), Mason (1948) và đã được sửa đổi bởi Cooksey và cộng sự (1997); gần đây nhất là công trình nghiên cứu của Schallreuter và cộng sự (2008) đã làm sáng tỏ hơn các vấn đề trong quá trình này. Đầu tiên, melanin xuất hiện trên cơ thể động vật được gây ra bởi quá trình oxy hóa của axit amin L-tyrosine được thể hiện trong Hình. Một phản ứng quan trọng trong quá trình hình thành sắc tố là sự oxy hóa tyrosin thành dopaquinon.
Đây là phản ứng quyết định tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp tyrosin do chuỗi phản ứng còn lại có thể tự diễn ra tại một giá trị pH nhất định. Dopaquinon sinh ra được chuyển thành leukodopachrom, sau đó chuyển thành dopachrom. Cuối cùng eumelanin được hình thành thông
16
qua một loạt các phản ứng oxy hóa từ các sản phẩm chuyển hóa của dopachrom là 5,6- dihydroxyindol (DHI) và acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic (DHICA). Trong trường hợp có sự có mặt của cystein hoặc glutathion, dopaquinon sẽ được chuyển hóa thành cysteyldopa hoặc glutathionyldopa. Cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng để tạo thành pheomelanin (Chang T. S. , (2009); Kim Y. J., Uyama H. (2005).
Hình 1. 3. Quá trình hình thành melanosis
Vị trí hoạt động của PPO bao gồm hai nguyên tử đồng với ba trạng thái, ‘met,‘ deoxy, và ‘oxy, (Rodriguez-Lopez, Tudela, Varon, Garcia-Carmona, & Garcia-Canovas, 1992). PPO là một enzyme nhị phân, xúc tác hai phản ứng cơ bản, với sự có mặt của oxy phân tử, o-hydroxyl hóa monophenol để tạo ra o-diphenol (monophenoloxidase, EC 1.14.18.1) và quá trình oxy hóa tiếp theo của o-diphenol (diphenoloxidase, EC 1.10.3.1) (Garcia-Molina, Penalver, Rodriguez- Lopez, Garcia-Canovas, & Tudela, 2005). PPO xúc tác quá trình oxy hóa phenol thành o- quinone để dễ dàng tham gia phản ứng hơn. Cụ thể, ở dạng phân này giúp dễ dàng tham gia vào các phản ứng trùng hợp để tạo thành các hợp chất có trọng lượng phân tử cao như các hắc sắc tố (melanin) hoặc phản ứng với các axit amin và protein làm tăng khả năng hình thành các đốm đen trên bề mặt các loài giáp sát (Stewakul, Visessanguan, & Tanaka, 2006).
PPO tồn tại trong động vật giáp xác dưới dạng zymogens (proPPO) (Kim et al., 2000).PPO vẫn hoạt động cho đến khi tôm được đông lạnh hoặc nấu chín. Các đốm đen trên tôm bắt đầu hình thành trên đầu tiến dần xuống chân và đuôi tôm, tạo thành các đường đen ngay dưới vỏ. Làm lạnh hoặc bảo quản trên đá làm chậm lại, nhưng không ngăn cản phản ứng này vì hệ thống enzym PPO vẫn hoạt động trong những điều kiện này. Ở động vật giáp xác, PPO có
17
liên quan đến quá trình xơ cứng biểu bì và chữa lành vết thương. Vì vậy, phải cẩn thận trong quá trình thu hoạch để tránh làm tổn thương động vật làm kích hoạt quá trình melanosis phát triển. Trong giai đoạn sau thu hoạch, pro-PPO có thể được kích hoạt thông qua các enzyme phân giải protein qua đường tiêu hóa của giáp xác; sự thủy phân gây ra bởi các protease này cũng tạo ra chất nền cho PPO hoạt động (Montero và cộng sự, 2001; Zamorano và cộng sự, 2009). Một số nghiên cứu khác cũng đã phát hiện ra rằng khoảng pH để PPO hoạt động tối ưu là pH=6.0- 8.0. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định của PPO ở động vật giáp xác cho thấy các enzyme có các vùng ổn định tương tự nhau giữa các loài. Độ ổn định của PPO rất khác nhau tùy thuộc vào một số yếu tố như nhiệt độ, pH, chất nền được sử dụng, nồng độ ion, hệ thống đệm và thời gian ủ (Kim và cộng sự, 2000).
1.2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành Melanosis
Khả năng hình thành melanosis ở giáp xác thay đổi tùy theo loài do sự khác biệt về nồng độ cơ chất và enzyme (Stewakul và cộng sự, 2005). Sự hình thành melanosis có thể được kiểm soát bằng cách giảm o-quinone thành diphenol như kiểm soát nguồn cung cấp oxy, cung cấp thêm một nồng độ ion đồng nhất định tại vị trí hoạt động của PPO và sử dụng các chất ức chế (Kim, Marshall, & Wei, 2000). Ngoài ra, quá trình này còn bị ảnh hưởng bởi bởi nhiều yếu tố khác như pH, nhiệt độ, phương pháp chiếu xạ, công nghệ thu hoạch, bảo quản,…
1.2.3. Các phương pháp ức chế sự hình thành Melanosis Nhiệt độ Nhiệt độ
Đối với việc xử lý ở nhiệt độ thấp thì phương pháp lạnh đông ở nhiệt độ -18°C hoặc thấp hơn thường được sử dụng để duy trì chất lượng thực phẩm trong một khoảng thời gian dài do enzyme bị bất hoạt. Theo truyền thống thì việc bảo quản các sản phẩm thực phẩm thủy sản tươi thường sử dụng nước đá với các hình thức khác nhau như nước đá lỏng và nước đá vảy (Aubourg và cộng sự., 2007). Tuy nhiên, phương pháp lạnh đông này cũng gây ra những thay đổi vật lý và hóa học ở hải sản nếu lưu trữ trong thời gian dài và dẫn đến làm thay đổi các đặc điểm cảm quan quan trọng. Trong giai đoạn thuỷ hải sản được bảo quản bằng nước đá, melanosis vẫn tiếp tục hình thành trong khoảng từ 2 đến 4 ngày sau thu hoạch; và khi được rã đông, tôm đông lạnh cũng xuất hiện những đốm đen (Rotllant và cộng sựu, 2002). Vì thế, những kỹ thuật này không hoàn toàn hiệu quả vì vẫn chưa giải quyết được triệt để các tác nhân xúc tác phản ứng melanosis.
18
Bao bì khí quyển biến đổi (MAP) từ lâu đã trở thành một kỹ thuật bảo quản thực phẩm tối ưu và được sử dụng ngày càng phổ biến. Các nghiên cứu khi bảo quản tôm hùm Na Uy bằng phương pháp này cho thấy tôm có thể giữ được phẩm chất và đạt các yêu cầu sử dụng lâu hơn các phương pháp truyền thống đến 100 lần (Gornik, Albalat, Theethakaew, & Neil, 2013). Ảnh hưởng của phương pháp này đến sự phát triển của vi sinh vật là do sự hiện diện của khí carbon dioxide (CO2) giúp kéo dài giai đoạn tiềm phát (pha lag) và làm giảm tốc độ phát triển của vi khuẩn trong giai đoạn sinh trưởng (pha logarit) ở vi sinh vật ưa khí và kỵ khí. Ngoài ra, MAP không chứa O2 góp phần tăng thêm hiệu quả trong việc làm chậm quá trình hư hỏng do enzyme PPO, giúp ngăn chặn sự phát triển của melanosis ở động vật giáp xác (Bono, Badalucco, Cusumano, & Palmegiano, 2012), tuy nhiên đối với tôm thẻ chân trắng L. vannamei thì phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế (Nirmal & Benjakul, 2011b).
Phụ gia
Sulphite- đặc biệt là metabisulphite natri (SMS) là phụ gia được sử dụng rộng rãi và hiệu quả nhất hiện nay để ngăn ngừa sự phát triển của melanosis ở động vật giáp xác (Bono et al., 2012; Lopez-Caballero, Martínez- Alvarez, Gomez-Guill en, & Montero, 2006 ; Nirmal & Stewakul, 2009). Sulphit và các dẫn xuất của chúng được sử dụng rộng rãi như chất ức chế PPO thông qua việc ngăn chặn quá trình polyme hóa các quinon, kết hợp không thuận nghịch với chúng và tạo thành các hợp chất không màu (Montero và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, các tác nhân sulphiting được biết là có thể tạo ra các phản ứng dị ứng và rối loạn nghiêm trọng ở các bệnh nhân hen (DeWitt, 1998). Đối với chất nền là catechol, sự ức chế hình thành melanonsis liên quan đến phản ứng của nucleophin với ion sulfite ở vị trí 4 của oquinone để tạo ra 4- sulfocatechol sau khi thêm ion hydro làm cho nồng độ quinone đã bị giảm trong phản ứng (Kim và cộng sự, 2000).
19
Hình 1. 4. Cơ chế ức chế phản ứng hình thành các melanosis của sulphite.
Hiện nay, 4-hexylresorcinol (4-HR) - một loại phụ gia có nguồn gốc từ thiên nhiên được xem là sự thay thế an toàn cho phụ gia SMS và các phương pháp xử lý bằng sulfite khác (Gomez- Guill en, 2006). Sử dụng 4-HR được cho phép ở Hoa Kỳ, Canada, Úc và một số quốc gia Mỹ Latinh (Martínez-Alvarez et al., 2007). Phụ gia 4-HR có một số lợi thế so với sulfite khi có tác dụng ở nồng độ sử dụng thấp, không có khả năng tẩy các sắc tố có lợi và có tính ổn định hóa học hơn (Kim et al., 2000). Ngoài ra, phụ gia 4-HR còn được sử dụng kết hợp với axit ascorbic để tăng hiệu quả. Axit ascoricic làm giảm quinone được tạo ra bởi polyphenoloxyase để làm chậm quá trình hóa nâu, trong khi 4-HR là chất ức chế đặc hiệu của PPO, tương tác với PPO và làm cho PPO không có khả năng xúc tác cho phản ứng hình thành melanosis.et
Chất thay thế
Phenolic trong thực vật được xem như là chất phụ gia tự nhiên tiềm năng, vì chúng có hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn mạnh (Banerjee, 2006). Các hợp chất này chủ yếu là tocopherol, flavonoid, dẫn xuất axit cinnamic và coumarin; chúng hiện diện trong nhiều loại thực vật như nho, trà xanh và một số loài thực vật khác với tác dụng chống oxy hóa dẫn đến khả năng ức chế các phản ứng PPO được hình thành (Kim và cộng sự., 2000).
Gần đây, chiết xuất enokitake và chiết xuất hạt nho đã được nghiên cứu trong việc ức chế sự hình thành melanosis ở tôm. Để duy trì chất lượng tôm trong quá trình xử lý, chế biến và bảo quản cần bổ sung các chất có khả năng ức chế quá trình hình thành melanosis ở tôm (Nirmal & Carloakul, 2012). Phương pháp ức chế sự hình thành melanosis chủ yếu bằng việc tác động
20
lên các điều kiện ảnh hưởng đến phản ứng như sự tiếp xúc của enzyme với oxy, nồng độ ion đồng có trong phản ứng (Gokoglu & Yerlikaya, 2008).
Chiết xuất từ enokitake, nấm kim châm được xem như là nguồn cung cấp chất chống oxy hóa tự nhiên và các chất ức chế sự hình thành melanosis tiềm năng (Jang và cộng sự, 2003). Hạt nho cũng là nguồn cung cấp các hợp chất phenol đơn phân phong phú như catechin, epicatechin, epicatechin-3-ogallate, dimeric, trimeric và tetrameric Procyanidin (Gokoglu & Yerlikaya, 2008).
1.3. Tổng quan về me
1.3.1. Mô tả thực vật và phân bố sinh thái
Cây me có tên khoa học là Tamarindus india. Đây là loại cây nhiệt đới, thân gỗ, có thể cao tới 30 mét tán lá rộng, nhiều lá (Jambulingam và Fernandes, (1986); Storrs, (1995)) và là cây thường xanh. Cây me có khả năng phát triển trong đất thiếu dinh dưỡng vì khả năng cố định đạm của chúng và chịu được thời gian hạn hán kéo dài (Felker, 1981). Mùa ra hoa quả: từ tháng 3 đến tháng 6 và tháng 12. Tốc độ sinh trưởng: Trung bình. Cây ưa sáng, thích hợp với nhiều loại đất. Có khả năng chịu được các điều kiện bất lợi của môi trường: hạn, thiếu dinh dưỡng… vì có hệ rễ phát triển rộng và sâu (Felker và Clark, 1980).
Là loại cây đa năng, vì nhiều bộ phận khác nhau của cây đều có thể được sử dụng cho nhiều mục đích. Vị ngọt / chua độc đáo của thịt quả là phổ biến trong nấu ăn và hương liệu. Hầu như tất cả các bộ phận của cây (gỗ, rễ, lá, vỏ và quả) đều có giá trị trong sinh hoạt nếu người dân nông thôn và một số ứng dụng thương mại được biết đến, những ngành khác đã phát triển tiềm năng.
Bảng 1. 4. Phân loại me theo tên khoa học (Hayati, E. I, 2015).
Giới (regnum) Plantae
Ngành (phylum) Magnoliophyta
Lớp(class) Magnoliopsida
Bộ (ordo) Fabales
Họ (familia) Fabaceae
Phân họ (subfamilia) Caesalpinioideae
21
Chi (genus) Tamarindus
Loài (species) T. indica
Cây me ( Tamarindus indica L.) có nguồn gốc từ châu Phi ( Diallo và cộng sự, 2008 , El-Siddig và cộng sự, 2006 ), nhưng ngày nay nó được phân bố ở hơn 50 quốc gia nhiệt đới ( El- Siddig và cộng sự, 2006). Ở châu Á (Ấn Độ, Thái Lan, Sri Lanka và Indonesia) và Nam Mỹ (Mexico, Brazil, Venezuela và Costa Rica), cây me thường được trồng để sản xuất trái cây thương mại, trong khi thương mại hóa này chưa được phát triển ở châu Phi. Ở Việt Nam, cây me được trồng khắp mọi nơi, nó được trồng làm cây xanh công trình như dọc theo các con đường, trong sân vườn, công viên và dùng làm cây ăn quả….
1.3.2. Nghiên cứu thành phần hoá học
Hình 1. 5. Quả me.
Trong quả me chứa khoảng 55% thịt quả, 34% hạt và 11% vỏ và chất xơ (Rao và Srivastava, 1974). Quả me có hình trái xoan, vỏ có hình thuôn hoặc hình xúc xích, cong hoặc thẳng, có đầu tròn. Vỏ có màu xanh nhạt hoặc nâu sần sùi và có vảy nhỏ, thường không đều giữa các hạt, giòn và dễ bị vỡ nếu ép vào quả. Thịt quả có dày và màu nâu đen (Coronel, 1991; Purseglove, 1987).
22
Hình 1. 6. Hạt me.
Hạt bao gồm vỏ bên ngoài hạt (20-30%) và nhân hoặc nội nhũ (70-75%) (Coronel, 1991; Shankarracharya, 1998). Hạt me là nguyên liệu thô được sử dụng trong sản xuất bột hạt me (TKP), polysaccharide (jellose), chất kết dính và tanin. Ngoài ra, hạt mẹ cũng được sử dụng cho các mục đích khác và hiện nay có tầm quan trọng như là một nguồn protein thay thế, giàu một số axit amin quan trọng.
Các hợp chất phân lập từ hạt me (Foo và Karchesy ,1989): Campesterol ; β-amyrin ; β-sitosterol ; palmitic acid; oleic acid ; eicosanoic acid ; uzarigenin-3-O-β-Dxylopyranosyl (1-2)-α-L rhamnopyranoside ; 2-hydroxy-3’,4’-dihydroxyacetophenone; metyl 3,4- dihydroxybenzoate ; 3,4-dihydroxyphenylacetat ; (+)-epicatechin ; procyanidin B2 ; procyanidin trimer ; procyanidin tetramer ; procyanidin pentamer ; procyanidin hexamer. Trong đó, bằng phương pháp sắc ký lỏng áp suất cao HPLC các nhà khoa học đã phân lập và xác định được bốn hợp chất chất chống oxy hóa (2-hydroxy-3’,4’- dihydroxyacetophenone; metyl 3,4-dihydroxybenzoate ; 3,4-dihydroxyphenylacetat ;(+)- epicatechin) từ dịch trích ethyl acetate từ hạt me của cây T. indica(Tsuda, T.và cộng sự, 1994). Phân tích sắc ký pha đảo HPLC của cao methanol của hạt me, cho thấy sự hiện diện của tám thành phần chính trong đó có Procyanidin B2 , (+)-epicatechin , Procyanidin trimer , Procyanidin tetramer , Procyanidin pentamer , Procyanidin hexamer , và tannin(Sudjaroen và cộng sự, 2005) .
23
(+)-epicatechin R= COCH2OH: 2-hydroxy-3’,4’-dihydroxyacetophenone R= COOCH3: metyl 3,4-dihydroxybenzoate
R= OCOCH3: 3,4-dihydroxyphenylacetate
procyanidin B2 procyanidin trimer
Hình 1. 7. Cấu trúc một số hợp chất polyphenol và flavonoid từ cây T. indica.
1.3.3. Nghiên cứu dược học
Nghiên cứu dân gian
Tamarindus indica L. là một trong những loài cây họ đậu quan trọng nhất. Quả me thường được sử dụng như một phương thuốc sức khỏe trên khắp Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ. Các sản phẩm từ cây me, lá, quả và hạt đã được sử dụng rộng rãi trong y học Ấn Độ và y học cổ truyền châu Phi (Rao, Y. S., & Mathew, K. M. (2012).
Ở dạng nước giải khát, me thường được sử dụng để điều trị tiêu chảy, táo bón, sốt và loét dạ dày. Vỏ cây và lá cũng được sử dụng để thúc đẩy quá trình lành vết thương. Các nhà nghiên cứu hiện đại đang nghiên cứu loại cây này để sử dụng thuốc tiềm năng (Kuru, P, 2014).
Trong y học, theo đông y quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng. Vỏ cây me có vị chát, có tác dụng làm săn da, dùng
24
làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa (kiết lỵ, ỉa chảy...) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi (Đỗ Tất Lợi,2004).
Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me còn có tác dụng như: Quả me