1.3.1. Mô tả thực vật và phân bố sinh thái
Cây me có tên khoa học là Tamarindus india. Đây là loại cây nhiệt đới, thân gỗ, có thể cao tới 30 mét tán lá rộng, nhiều lá (Jambulingam và Fernandes, (1986); Storrs, (1995)) và là cây thường xanh. Cây me có khả năng phát triển trong đất thiếu dinh dưỡng vì khả năng cố định đạm của chúng và chịu được thời gian hạn hán kéo dài (Felker, 1981). Mùa ra hoa quả: từ tháng 3 đến tháng 6 và tháng 12. Tốc độ sinh trưởng: Trung bình. Cây ưa sáng, thích hợp với nhiều loại đất. Có khả năng chịu được các điều kiện bất lợi của môi trường: hạn, thiếu dinh dưỡng… vì có hệ rễ phát triển rộng và sâu (Felker và Clark, 1980).
Là loại cây đa năng, vì nhiều bộ phận khác nhau của cây đều có thể được sử dụng cho nhiều mục đích. Vị ngọt / chua độc đáo của thịt quả là phổ biến trong nấu ăn và hương liệu. Hầu như tất cả các bộ phận của cây (gỗ, rễ, lá, vỏ và quả) đều có giá trị trong sinh hoạt nếu người dân nông thôn và một số ứng dụng thương mại được biết đến, những ngành khác đã phát triển tiềm năng.
Bảng 1. 4. Phân loại me theo tên khoa học (Hayati, E. I, 2015).
Giới (regnum) Plantae
Ngành (phylum) Magnoliophyta
Lớp(class) Magnoliopsida
Bộ (ordo) Fabales
Họ (familia) Fabaceae
Phân họ (subfamilia) Caesalpinioideae
21
Chi (genus) Tamarindus
Loài (species) T. indica
Cây me ( Tamarindus indica L.) có nguồn gốc từ châu Phi ( Diallo và cộng sự, 2008 , El-Siddig và cộng sự, 2006 ), nhưng ngày nay nó được phân bố ở hơn 50 quốc gia nhiệt đới ( El- Siddig và cộng sự, 2006). Ở châu Á (Ấn Độ, Thái Lan, Sri Lanka và Indonesia) và Nam Mỹ (Mexico, Brazil, Venezuela và Costa Rica), cây me thường được trồng để sản xuất trái cây thương mại, trong khi thương mại hóa này chưa được phát triển ở châu Phi. Ở Việt Nam, cây me được trồng khắp mọi nơi, nó được trồng làm cây xanh công trình như dọc theo các con đường, trong sân vườn, công viên và dùng làm cây ăn quả….
1.3.2. Nghiên cứu thành phần hoá học
Hình 1. 5. Quả me.
Trong quả me chứa khoảng 55% thịt quả, 34% hạt và 11% vỏ và chất xơ (Rao và Srivastava, 1974). Quả me có hình trái xoan, vỏ có hình thuôn hoặc hình xúc xích, cong hoặc thẳng, có đầu tròn. Vỏ có màu xanh nhạt hoặc nâu sần sùi và có vảy nhỏ, thường không đều giữa các hạt, giòn và dễ bị vỡ nếu ép vào quả. Thịt quả có dày và màu nâu đen (Coronel, 1991; Purseglove, 1987).
22
Hình 1. 6. Hạt me.
Hạt bao gồm vỏ bên ngoài hạt (20-30%) và nhân hoặc nội nhũ (70-75%) (Coronel, 1991; Shankarracharya, 1998). Hạt me là nguyên liệu thô được sử dụng trong sản xuất bột hạt me (TKP), polysaccharide (jellose), chất kết dính và tanin. Ngoài ra, hạt mẹ cũng được sử dụng cho các mục đích khác và hiện nay có tầm quan trọng như là một nguồn protein thay thế, giàu một số axit amin quan trọng.
Các hợp chất phân lập từ hạt me (Foo và Karchesy ,1989): Campesterol ; β-amyrin ; β-sitosterol ; palmitic acid; oleic acid ; eicosanoic acid ; uzarigenin-3-O-β-Dxylopyranosyl (1-2)-α-L rhamnopyranoside ; 2-hydroxy-3’,4’-dihydroxyacetophenone; metyl 3,4- dihydroxybenzoate ; 3,4-dihydroxyphenylacetat ; (+)-epicatechin ; procyanidin B2 ; procyanidin trimer ; procyanidin tetramer ; procyanidin pentamer ; procyanidin hexamer. Trong đó, bằng phương pháp sắc ký lỏng áp suất cao HPLC các nhà khoa học đã phân lập và xác định được bốn hợp chất chất chống oxy hóa (2-hydroxy-3’,4’- dihydroxyacetophenone; metyl 3,4-dihydroxybenzoate ; 3,4-dihydroxyphenylacetat ;(+)- epicatechin) từ dịch trích ethyl acetate từ hạt me của cây T. indica(Tsuda, T.và cộng sự, 1994). Phân tích sắc ký pha đảo HPLC của cao methanol của hạt me, cho thấy sự hiện diện của tám thành phần chính trong đó có Procyanidin B2 , (+)-epicatechin , Procyanidin trimer , Procyanidin tetramer , Procyanidin pentamer , Procyanidin hexamer , và tannin(Sudjaroen và cộng sự, 2005) .
23
(+)-epicatechin R= COCH2OH: 2-hydroxy-3’,4’-dihydroxyacetophenone R= COOCH3: metyl 3,4-dihydroxybenzoate
R= OCOCH3: 3,4-dihydroxyphenylacetate
procyanidin B2 procyanidin trimer
Hình 1. 7. Cấu trúc một số hợp chất polyphenol và flavonoid từ cây T. indica.
1.3.3. Nghiên cứu dược học
Nghiên cứu dân gian
Tamarindus indica L. là một trong những loài cây họ đậu quan trọng nhất. Quả me thường được sử dụng như một phương thuốc sức khỏe trên khắp Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ. Các sản phẩm từ cây me, lá, quả và hạt đã được sử dụng rộng rãi trong y học Ấn Độ và y học cổ truyền châu Phi (Rao, Y. S., & Mathew, K. M. (2012).
Ở dạng nước giải khát, me thường được sử dụng để điều trị tiêu chảy, táo bón, sốt và loét dạ dày. Vỏ cây và lá cũng được sử dụng để thúc đẩy quá trình lành vết thương. Các nhà nghiên cứu hiện đại đang nghiên cứu loại cây này để sử dụng thuốc tiềm năng (Kuru, P, 2014).
Trong y học, theo đông y quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng. Vỏ cây me có vị chát, có tác dụng làm săn da, dùng
24
làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa (kiết lỵ, ỉa chảy...) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi (Đỗ Tất Lợi,2004).
Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me còn có tác dụng như: Quả me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ mang thai, điều trị nôn mửa, đầy hơi và khó tiêu; chữa cảm lạnh. Hạt me có tác dụng tẩy giun, lá me có tác dụng chữa rôm sảy, mẩn ngứa, vỏ cây me có tá dụng chữa táo, phòng và chữa viêm lợi, viêm nha chu. Hạt me rang được coi là một loại gia vị trong thực phẩm.
Hoạt tính sinh học
Hạt me chứa nhiều hợp chất polyphenol là các hợp chất có đặc tính chống oxy hóa và chống viêm. Những chất này có thể bảo vệ chống lại các bệnh như bệnh tim, ung thư và tiểu đường. Dịch trích từ hạt cũng có thể giúp hạ đường huyết và chiết xuất từ phần thịt me có thể giúp giảm trọng lượng cơ thể và đẩy lùi bệnh gan nhiễm mỡ (Kuru, P, 2014).
Hạt me có lợi ích kháng khuẩn có thể bảo vệ khỏi vi khuẩn gây viêm phổi, Typhus và
Staphylococcus aureus. Điều này cũng bảo vệ khỏi một loại vi khuẩn gây nhiễm trùng da cũng như nhiễm trùng đường ruột và đường tiết niệu (Daniyan và Muhammad, 2008). Vỏ ngoài màu đỏ của hạt me chữa tiêu chảy và kiết lỵ hiệu quả. Xyloglucan có thể được sử dụng như một chất thay thế tuyệt vời cho pectin trái cây nên có thể được sử dụng như một phương thuốc hiệu quả chống tiêu chảy, kiết lỵ và viêm đại tràng (Mishra và Malhotra, 2009; Rama Rao, 1975, Jayaweera, 1981).
Năm 2007, nghiên cứu của Landi Librandi AP và cộng sự đã chiết tách polysaccharide từ quả me và kết quả nghiên cứu cho thấy polysaccharide có khả năng chống oxy hóa, hạ cholesterol, giảm khả năng xơ vữa thành mạch máu. Một số nghiên cứu tạo một số dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của TSP có khả năng làm giảm đường huyết và chống bệnh tăng đường huyết (S. Jana và cộng sự, 2010.)
Năm 2010, Sougata và cộng sự đã chiết tách và tiến hành phân tích các tính chất của TSP và hướng đến sử dụng trong y học. Kết quả nghiên cứu chỉ ra TSP chiết tách được có thể sử dụng làm chỉ phẫu thuật trong y học. Trong nghiên cứu này cho thấy chỉ phẫu thuật có độ bền không khác chỉ phẫu thuật thông thường nhưng có cường độ cao hơn và có khả năng tự tiêu trong 2-6 giờ. Quang phổ FT-IR cho thấy không có sự tương tác giữa thuốc và polymer TSP. Do đó, TSP để sản xuất chỉ sử dụng cho việc phẫu thuật.
25
Bên cạnh đó nước ép hạt me có thể điều trị và bảo vệ khỏi ung thư ruột. Hoạt động chống ung thư và hoạt động điều tiết hệ miễn dịch của hạt me ngăn chặn sự di chuyển ung thư trong cơ thể. Dịch trích từ hạt làm giảm các dấu hiệu stress oxy hoá và làm chậm tiến trình ung thư biểu mô tế bào thận hoặc giảm tỉ lệ mắc bệnh. (Chabetty và cộng sự, 2012; Sano và cộng sự, 1996).
Các nghiên cứu của các tác giả chủ yếu tập trung nghiên cứu về cấu trúc của TSP và ứng dụng của TSP trong y học. Các nghiên cứu về thành phần hóa học, nghiên cứu về cấu trúc còn hạn chế.
Từ kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa và tyrosinase của 60 loại phụ phẩm Việt Nam (2014-2016) của nhóm tác giả P.T.A. Đào và cộng sự đã phát hiện ra cao chiết ethanol từ hạt me có hoạt tính cao tương ứng giá trị IC50 đối với phép thử ức chế gốc tự do DPPH là 6,91 µg/mL, phép thử ức chế H2O2 là 113,8 µg/mL, tổng hàm lượng flavonoid là 848,8 CE/100 g mẫu (Phan Thị Anh Đào và công sự, 2017).
1.3.4. Vấn đề tồn tại và mục tiêu nghiên cứu
Vấn đề tồn tại
Ngày nay, ngành thuỷ sản Việt Nam đã có những bước tiến vượt bậc nhờ những thành tựu về khoa học công nghệ, nhiều mô hình tốt được áp dụng vào sản xuất giống, thức ăn, nuôi, chế biến và xuất khẩu thuỷ sản. Trong đó, tôm là loài giáp xác còn đem lại hiệu quả kinh tế rất cao. Theo Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP) cho biết, tháng 6/2020, xuất khẩu tôm Việt Nam đạt 349,9 triệu USD, tăng 19,2% so với tháng 6/2019. Đây là mức tăng trưởng tốt nhất kể từ tháng 3/2020. Tôm còn cung cấp nguồn protein cực kỳ tốt, nhưng lại rất ít chất béo và calories, chính vì vậy chúng trở thành thực phẩm tốt cho sức khỏe (Jayasree và cộng sự, 2017). Do đó, việc bảo quản tôm trong quá trình vận chuyển và xuất khẩu để đảm bảo chất lượng tôm là rất quan trọng và trong đó là vấn đề tôm bị biến đổi đốm đen tuy không ảnh hưởng nhiều đến việc giảm chất lượng của tôm nhưng mà đây là vấn đề ảnh hưởng lớn đến mặt cảm quan và giá trị kinh tế. Dẫn xuất Sulfite được sử dụng rộng rãi như chất chống oxy hóa và / hoặc chất bảo quản trong thực phẩm. Việc bổ sung sulfites, chủ yếu là metabisulfite, để tránh hiện tượng biến đổi đốm đen trong tôm và đã trở thành một thói quen trên toàn thế giới trong nhiều năm (Williams và cộng sự, 1990). Một
26
trong những phương pháp rẻ nhất, dễ nhất và hiệu quả nhất để ngăn ngừa đốm đen là sử dụng sulfites (Smith, 1980). Tuy nhiên, các tác nhân sulfite được biết là tạo ra các phản ứng dị ứng, các rối loạn nghiêm trọng trong các đối tượng hen suyễn (DeWitt, 1998) và một số nước còn nghiêm cấm sử dụng chất này như Nhật Bản. Vì vây, các nghiên cứu về việc sử dụng các hợp chất chống biến đổi đốm đen trong tôm có nguồn gốc từ tự nhiên đang được hướng đến để ứng dụng vào thực tế giải quyết các vấn đề gặp phải trên.
Me cũng như những bộ phận khác của nó có các hoạt tính mang lại rất nhiều lợi ích đã có nhiều tác giả đã công bố về các ứng dụng đa dạng của cây me và được đưa vào sử dụng trong cuộc sống như đã nêu trên. Tuy nhiên cây me vẫn còn có rất nhiều tiềm năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá trị của cây me nhất là trong lĩnh vực dinh dưỡng và dược phẩm. Đặc biệt, trong hạt me là một phụ phẩm từ ngành chế biến thực phẩm (me đóng hộp, nước me đóng chai, kẹo me,…) chứa thành phần polyphenol rất lớn và cũng được nghiên cứu sàng lọc có khả năng ức chế hoạt động enzyme tyrosinase (Thongmuang, P., & Sudjaroen, Y, 2013). Nhưng chưa được nghiên cứu sâu, gây lãng phí một nguồn polyphenol tự nhiên không được khai thác hết tiềm năng.
Gần đây, mối quan tâm tìm kiếm các chất chống oxy hóa tự nhiên, đặc biệt là các chất có nguồn gốc thực vật, đã tăng lên rất nhiều (Murtaza và cộng sự, 2013; Thornfeldt 2005). Các chất chống oxy hóa tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật, đặc biệt là phenol như quercetin, carnosol, thymol, catechin và morin, được quan tâm đáng kể như chất bổ sung chế độ ăn uống hoặc chất bảo quản thực phẩm (Sher và cộng sự, 2012). Chẳng hạn như đề tài sàng lọc thực vật có hoạt tính chống oxy hóa và áp dụng trong chế biến thủy sản của Nguyễn Xuân Duy, 2013. Dựa vào đó, chúng tôi giải quyết tình hình còn tồn tại của hai nguyên liệu trên bằng cách ứng dụng cao trích từ hạt me vào tôm thẻ chân trắng để nghiên cứu khả năng ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase từ đó đánh giá các biến đổi trong quá trình bảo quản, các hoạt tính sinh học cũng như khả năng ngăn chặn các biến đổi đốm đen sau 8 ngày bảo quản.
Mục tiêu nghiên cứu
Trong nghiên cứu “Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của cao trích hạt me và ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng”, chúng tôi đã thực hiện một số khảo sát về thành phần cũng như hoạt chất của các mẫu cao trích từ hạt me như sau:
27
a. Điều chế cao trích methanol, cao phân đoạn: nước, ethyl acetate từ bột hạt me. Trong đó, có các chỉ tiêu cần xác định như độ ẩm nguyên liệu, hiệu suất của quá trình trích ly, phân lập và định danh các hợp chất polyphenol có trong hạt me.
b. Khảo sát hoạt tính của các cao trích bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picryhydraxyl (DPPH), phương pháp xác định tổng hàm lượng polyphenol, phương pháp xác định hoạt tính khử (Fe3+), và khảo sát khả năng ức chế enzyme tyrosinase. c. Ứng dụng cao trích có hoạt tính mạnh nhất lên bảo quản tôm. Đánh giá mức độ hình thành điểm biến đen trên tôm bằng cảm quan, đánh giá khả năng ức chế sự hình thành peroxide ở tôm trong quá trình bảo quản bằng phương pháp xác định các chất phản ứng acid thiobarbituric (TBARS), sự thay đổi pH và xác định lượng vi sinh vật trên tôm sau 8 ngày bảo quản.
28
d.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu
Me chín được thu mua từ chợ đầu mối Bình Điền (huyện Bình Chánh, thành phố Hồ Chí Minh) vào tháng 02/2020, sau đó tách bỏ phần thịt me để lấy hạt me, sau khi loại bỏ những hạt me bị hư, có mối mọt, hạt me được đem đi rửa lại bằng nước sạch và phơi khô cho đến khi ráo nước.
Tôm thẻ chân trắng được thu mua ở chợ Bắc Ninh (quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh) vào lúc sáng sớm, khi mua chọn những con tôm còn tươi sống, kích cỡ khoảng 32-35 con/kg, sau đó được đem đi bảo quản ngay trong thùng xốp có sẵn và được sử dụng ngay trong ngày.
2.1.2. Hoá chất
- Etyl acetat (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Hexane (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Ethanol 96% và 99.5% (Chemsol, Việt Nam) - Methanol 99.5% (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Sodium metabisulfite (SMS) (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (FC) (Merck, Đức)
- Acid gallic (Sigma-Aldrich, USA)
- Trichloroacetic acid (TCA) (Merck, Đức)
- Tyrosinase from mushroom (Sigma-Aldrich, USA) - Kali hydrophotphat (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Mono Kali Photphat (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Ferricyanide kali (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Thiobarbituric acid (TBA) (Sigma-Aldrich, USA) - Ferric chloride (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, USA) - L −3,4 dihydroxylphenylalanine (L-DOPA) (Sigma-Aldrich, USA)
29
- Malondialdehyde (MDA) (Eagle Biosciences, USA)
2.1.3. Thiết bị
- Bể điều nhiệt (Memmert, Đức)
- Cân phân tích 4 số (Precisa, Thụy Sỹ) - Cuvette thủy tinh (Chrom Tech, USA)
- Hệ thống cô quay chân không (Yamamoto, Nhật Bản) - Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis (Hitachi, Nhật Bản).
- Máy đo pH (Seven easy pH, Trung Quốc)
- Máy đồng hóa (Ika, Đức)
- Máy ly tâm (Hettich, Đức)
- Micropipette (Winlab, Đức)
- Tủ lạnh (Hitachi, Nhật Bản)
- Tủ đông (Templow, Spain)
- Tủ sấy (Memmert, Đức)
- Các dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm.
2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
30
Hình 2. 1. Quá trình nghiên cứu.
Quá trình nghiên cứu.
Điều chế cao trích
Hạt me sau khi thu nhận sẽ được rửa sạch, sấy khô (độ ẩm 8-10%), xay nghiền thành bột và đóng gói bảo quản. Bột hạt me được trích ly bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi methanol, sau đó được trích ly phân đoạn với dung môi ethyl acetate thu được cao
Hạt me
Điều chế cao trích
Sàng lọc hoạt tính của các mẫu cao
Khảo sát thành phần
Ứng dụng lên bảo quản tôm
Kiểm định vi sinh
Nhận xét, kết luận
Tính hiệu suất thu hồi
- Xác định tổng hàm lượng polyphenol. - Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. - Xác định khả năng khử sắt của cao trích. - Khảo sát khả năng kháng enzyme tyrosinase..
-Xác định pH -TBARS
31
methanol, cao ethyl acetate và cao nước. Sàng lọc hoạt tính
Ba mẫu cao trích sẽ được thực nghiệm khảo sát về xác định tổng polyphenol, năng