Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp trích ly

Đề tài chọn phƣơng pháp ngâm dầm bột cây ở nhiệt độ phòng để trích ly các hợp chất ra khỏi bột cây và phƣơng pháp chiết pha rắn trên silica gel để phân loại cao theo độ phân cực tăng dần.

2.2.2. Phương pháp thử nghiệm độ tinh khiết

Sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng có chiều cao 5 cm, bề rộng tùy thuộc vào số lƣợng mẫu cần kiểm tra, pha động là hệ dung môi đƣợc lựa chọn cho phù hợp với mỗi loại cao, mỗi loại chất dựa vào độ phân cực của mẫu.

Cụ thể, mẫu cao có độ phân cực thấp sẽ đƣợc giải ly với hệ dung môi HEX:EA để dò tìm tỷ lệ sao cho các vết trải đều trong đoạn từ vạch tiền tuyến đến vạch xuất phát dung môi, các mẫu có độ phân cực mạnh thì sẽ đƣợc giải ly trong hệ dung môi CH:MeOH. Sau đó, TLC đƣợc hiện hình bằng các phƣơng pháp vật lý, hóa học.

2.2.3. Phương pháp cô lập các hợp chất

Sắc ký cột cổ điển là phƣơng pháp dễ dàng thực hiện với điều kiện phòng thí nghiệm và tối ƣu về kinh tế nên đây là phƣơng pháp chính dùng để nghiên cứu phân lập, tinh chế các hợp chất hữu cơ trong luận văn.

Các bƣớc tiến hành sắc ký cột nhƣ sau:

 Cột sắc ký đƣợc làm sạch sấy khô, tráng acetone, lót bông ở trƣớc khóa cột.

 Silica gel (khôi lƣợng gấp 10÷20 lần lƣợng mẫu) đƣợc ngâm trong dung môi n- hexane để trƣơng nở (10 phút, đậy kín dụng cụ chứa bằng giấy bạc) trƣớc khi nạp cột.

 Thêm lƣợng dung môi đến 1/2 chiều cao cột

 Mở khóa cột và cho lƣợng chất hấp phụ đã trƣơng nở lên cột, để chất hấp phụ lắng yên rót thêm dung môi vào xả cột để cột ổn định (30 phút).

 Sau khi dung môi cách phần chất hấp phụ 0.5 cm, tiến hành nạp mẫu.

Chuẩn bị mẫu: do mẫu khó tan trong dung môi nạp cột nên phƣơng pháp nạp mẫu khô đƣợc lựa chọn. Mẫu chất đƣợc làm khô bằng máy cô quay chân không (tốc độ quay:

19

80 vòng/ phút, nhiệt độ bể: 55 °C, áp suất 250÷300 hPa), và trộn với silica gel lần lƣợt từng lƣợng nhỏ để tơi hoàn toàn.

2.2.4. Phương pháp nhận danh và giải đoán cấu trúc

Vận dụng kết hợp các phƣơng pháp phổ nghiệm một chiều (1H, 13C-NMR, DEPT), hai chiều (HSQC, HMBC) và phổ khối MS cùng với so sánh các tài liệu tham khảo để giải đoán cấu trúc và nhận danh các hợp chất hữu cơ đã cô lập.

2.3. Xử lý nguyên liệu

Cây An Xoa (Helicteres hirsuta L.) đƣợc thu hái tại Xã Bù Nho, Huyện Phƣớc Long, Tỉnh Bình Phƣớc. Cây đƣợc định danh bởi TS. Nguyễn Hữu Trí, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phần thân và lá đƣợc rửa sạch tách riêng, sấy ở nhiệt độ 70 °C cho đến khi khối lƣợng không đổi. Thân và lá đƣợc xay nhuyễn thành bột mịn để thực hiện nghiên cứu.

2.4. Điều chế cao tổng

Cao tổng ethanol đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp ngâm dầm bột cây (bột thân 1,3 kg, bột lá 1,5 kg) với dung môi ethanol 96° trong bình thủy tinh dung tích 25 L trong 24 giờ, dịch trích ly đƣợc lọc qua giấy lọc nhanh loại bỏ cặn, tạp bẩn dạng hạt.

Dịch lọc đƣợc mang đi cô quay thu hồi dung môi, phần cao còn lại trong bình cô quay đƣợc chuyển ra beaker 250 mL để trên bể điều nhiệt 60 °C để bay hết dung môi. Thực hiện quá trình liên tục trong vòng 30 ngày thu đƣợc cao ethanol tổng của phần thân và lá.

2.5. Điều chế cao phân đoạn từ cao ethanol

Cao phân đoạn đƣợc điều chế bằng cách chiết pha rắn cao ethanol bằng cột nhồi silica gel. Lƣợng cao tổng sau khi làm khô đƣợc trộn với silica gel tỷ lệ 2 : 3 (mcao : msilica gel), đƣợc nạp lên đầu cột (d = 10 cm, msilica gel = 400 g). Tiến hành giải ly bằng các đơn dung môi, mỗi lần hứng 100 mL dịch, theo dõi quá trình giải ly bằng sắc ký lớp mỏng cho đến khi trên TLC không còn vết thì tiến hành xả khô cột sắc ký, chuyển sang đơn dung môi có độ phân cực mạnh hơn, kết quả phân loại cao đƣợc trình bày trong Bảng 2.1.

20

Bảng 2.1. Kết quả phân loại cao từ cao tổng

Phân đoạn Cao thân (58,11 g) Cao lá (87,80 g)

Ký hiệu Khối lƣợng (g) Ký hiệu Khối lƣợng (g)

n-hexane HTH 1,30 HLH 15,00 Chloroform HTC 11,84 HLC 7,80 Ethyl acetate HTE 3,76 HLE 2,80 Methanol HTM 22,34 HLM 37,80

Tổng (g) 39,24 Tổng (g) 63,40

Thu suất (%) 67,52 Thu suất (%) 72,20

2.6. Khảo sát các phân đoạn.

2.6.1. Khảo sát phân đoạn cao HTC.

TLC cao HTC có nhiều vết đậm màu nên đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn khác cho vệt không tách rõ nên sẽ đƣợc khảo sát khi có điều kiện và thời gian.

Bảng 2.2. Thực nghiệm sắc ký cột cao HTC

Ký hiệu Thứ tự hủ bi Hệ dung môi Khối lƣợng (g)

- 1-10 HEX - HC1 11-38 HEX:EA (9:1) 2,00 HC2 39-59 HEX:EA (9:1) 0,75 HC3 60-92 HEX:EA (8:2) 1,46 HC4 93-107 HEX:EA (8:2) 1,43 HC5 108-137 HEX:EA (8:2) 0,50 HC6 138-167 MeOH 0,30 Tổng (g) 6,14 Thu suất (%) 76,76

Cao HTC đƣợc chia làm 2 phần: phần thứ nhất (8.39 g) trộn với silica gel (12.5 g) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 5 cm và msilica gel = 250 g), giải ly lần lƣợt với HEX và tăng dần độ phân cực bằng EA, dịch giải ly đƣợc hứng vào các hủ bi thủy tinh dung tích 10

21

mL.Các hủ bi cho cùng kết quả TLC đƣợc gom lại, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột phân đoạn cao HTC đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.2. Phần còn lại của cao HTC đƣợc giữ lƣu mẫu.

Khảo sát phân đoạn HC2

Phân đoạn HC2 có vết chính màu tím khi hiện hình với acid H2SO4 40% nên đƣợc tiếp tục khảo sát. Phân đoạn HC2 (750 mg) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 2 cm, msilica gel = 22,5 g). Cột đƣợc giải ly với hệ dung môi HEX:EA 95:5, tăng dần độ phân cực bằng hệ dung môi HEX:EA 8:2, dịch giải ly đƣợc hứng vào các hủ bi thủy tinh dung tích 10 mL, các hủ bi cho sắc ký lớp mỏng giống nhau đƣợc gom chung, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thực nghiệm sắc ký cột phân đoạn HC2 Ký hiệu Thứ tự hủ bi Hệ dung môi Khối lƣợng (mg) Ghi chú

HC2.1 1-18 HEX:EA (95:5) 320 Khảo sát thu HC-A

HC2.2 19-21 HEX:EA (8:2) 90 Không khảo sát HC2.3 22-27 HEX:EA (8:2) 80 Không khảo sát HC2.4 28-42 HEX:EA (8:2) 45 Không khảo sát

Tổng (mg) 535

Thu suất (%) 71,33

Tinh sạch phân đoạn HC2.1: Phân đoạn HC2.1 (320 mg) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 1 cm, msilica gel = 9,6 g). Cột đƣợc giải ly với dung môi HEX, dịch giải ly hứng vào các hủ bi dung tích 10 mL, các phân đoạn giống nhau đƣợc gom lại, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả hủ bi số 44 đến hủ bi số 48 thu đƣợc chất rắn màu trắng kết tinh (200 mg), các phân đoạn truóc cho kết quả TLC nhiều vết không có vết mục tiêu nên không khảo sát. Chất rắn này tiếp tục đƣợc làm tinh bằng cột sắc ký có d = 1 cm, msili- ca gel = 6 g, giải ly với dung môi HEX, thu đƣợc 3 phân đoạn, trong đó phân đoạn thứ hai (21,2 mg) cho một vết màu tím khi giải ly TLC với hệ dung môi HEX:EA 9:1, phân đoạn này dƣợc đặt tên HC-A, các phân đoạn khác cho vết màu tím kéo dài nên sẽ đƣợc lƣu trữ và khảo sát khi có điều kiện.

22

Khảo sát phân đoạn HC5

Phân đoạn HC5 có vết màu hồng khi hiện hình với acid H2SO4 nên đƣợc tiếp tục khảo sát. Phân đoạn HC5 (500 mg) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 2 cm, msilica gel = 15 g). Cột đƣợc giải ly với hệ dung môi HEX:EA 95:5, tăng dần độ phân cực bằng hệ dung môi HEX:EA 9:1, dịch giải ly đƣợc hứng vào các hủ bi thủy tinh dung tích 10 mL, các hủ bi cho kết quả TLC giống nhau đƣợc gom chung, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.4. Phân đoạn HC5.5 (60.5 mg) đƣợc hòa tan trong dung môi HEX:EtOH (98:2) tối thiểu, nhiệt độ 40 °C, khi chất rắn đã tan hoàn toàn, tắt gia nhiệt để cho các tinh thể kết tinh ở nhiệt độ phòng 23÷30 °C, hút bỏ phần dịch thu phần kết tinh (17,5 mg), phần kết tinh đƣợc kiểm tra bằng TLC, kết quả cho một vết màu hồng với hệ dung môi HEX:EA 8:2. Chất rắn sau khi tinh sạch đƣợc đặt tên là HC-B.

Bảng 2.4. Thực nghiệm sắc ký cột phân đoạn HC5 Ký hiệu Thứ tự hủ bi Hệ dung môi Khối lƣợng (mg) Ghi chú

HC5.1 1-6 HEX:EA (95:5) 7,7 Không khảo sát HC5.2 7-18 HEX:EA (9:1) 265,4 Không khảo sát HC5.3 19-36 HEX:EA (9:1) 9,2 Không khảo sát HC5.4 40-44 HEX:EA (9:1) 22,8 Không khảo sát HC5.5 45-51 HEX:EA (9:1) 60,5 Khảo sát thu HC-B

Tổng (mg) 365,6

Thu suất(%) 73,08

2.6.2. Khảo sát phân đoạn cao HTE

Phân đoạn HTE có xuất hiện chất rắn màu trắng khi cô quay dịch giải ly bằng dung môi EA. Cao HTE (340 mg) đƣợc rửa bằng ethyl acetate (15  1 mL) tại nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần dung dịch, thu đƣợc 14.1 mg chất rắn màu trắng đặt tên HC-C, độ tinh sạch của chất rắn đƣợc kiểm tra bằng TLC với hệ dung môi giải ly CH:MeOH (9:1).

23

2.6.3. Khảo sát phân đoạn cao HLH

Cao HLH (10 g) đƣợc trộn với silica gel (15 g) nạp lên đầu cột sắc ký (d = 5 cm, msilica gel = 300 g). Giải ly bằng HEX và tăng dần độ phân cực bằng hệ dung môi HEX:EA 95:5, dịch giải ly đƣợc hứng vào các hủ bi dung tich 20 mL, các hủ bi có cùng kết quả TLC đƣợc gom lại chung. Kết quả sắc ký cột đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.5.

Tinh sạch phân đoạn HH5: phân đoạn HH5 có xuất hiện chất rắn, phân đoạn HH5 (550 mg) đƣợc rửa bằng dung môi HEX (51 mL), loại bỏ lớp dịch phía trên bằng pipette, độ tinh sạch của chất rắn đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng hệ dung môi HEX:EA 9:1. Kết quả thu đƣợc 5 mg chất rắn kết tinh hình kim đặt tên là HC-D.

Bảng 2.5. Thực nghiệm sắc ký cột cao HLH Ký hiệu Thứ tự hủ bi Hệ dung môi Khối lƣợng (g) Ghi chú

HH1 1-14 HEX 0,03 Không khảo sát

HH2 15-45 HEX 0,72 Không khảo sát

HH3 46-65 HEX 0,91 Không khảo sát

HH4 66-111 HEX 5,58 Không khảo sát

HH5 112-121 HEX:EA (95:5) 0,55 Khảo sát thu HC-D HH6 122-152 HEX:EA (95:5) 0,93 Không khảo sát

Tổng (g) 8,72

24

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất HC-A

Thông tin chung:

Hợp chất HC-A thu đƣợc khi sắc ký cột phân đoạn cao HTC-HC2, có các đặc điểm sau:

 Tinh thể hình kim màu trắng kết tinh trong chloroform

 Sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung môi HEX:EA (8:2), hiện hình bằng acid H2SO4 40%, nung nóng bản ở 110 °C cho một vết tròn màu tím, có Rf = 0,4.

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (Phụ lục 1), δ ppm: 5,35 (2H, d, J = 5 Hz, -CH=), 5,16 (1H, dd, J = 8,5 Hz & J = 15,5 Hz, -CH=), 5,02 (1H, dd, J = 8,5 Hz & J = 15 Hz, -CH=), 3,52 (2H, m, >CH-OH).

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (Phụ lục 2), δ ppm: 140,78 (>C=), 138,28 (-CH=), 129,33 ppm (-CH=), 121,68 ppm (-CH=), 71,81 ppm (>CH-OH).

Biện luận cấu trúc:

TLC hợp chất HC-A cho một vết màu tím khi hiện hình bản với H2SO4 40% hơ nóng bản, chất không hấp thu UV 365 nm và 254 nm nên hợp chất có thể là một steroid hoặc triterpenoid.

Phản ứng Salkowaki nhận biết steroid đƣợc thực hiện trong ống nghiệm với 1 mg mẫu đƣợc hòa tan trong 1 mL chloroform, sau đó thêm 1 mL H2SO4 đậm đặc cho phản ứng dƣơng tính màu đỏ nên HC-A là một steroid.

Phổ 1H-NMR có 03 tín hiệu tại δ ppm: 5,35; 5,16; 5,02; đây là tín hiệu của các proton nối với carbon olefin (-CH=C<). Tích phân của 3 tín hiệu này lần lƣợt là 1,0; 0,34; 0,32, điều này cho thấy thấy HC-A là hỗn hợp. So sánh với tài liệu tham khảo [26] (Bảng 3.1) cho thấy các tín hiệu này đặc trƣng cho hỗn hợp stigmasterol và β- sitosterol. Phổ 13C-NMR tại δ ppm: 140,78; 121,68; 138,28; 129,33 là các mũi carbon olefin của stigmasterol và β-sitosterol.

25

Tại 5,02 ppm (1H, dd, -CH=, H-22) và 5,15 ppm (1H, dd, -CH=, H-23) ghép cặp với nhau, cả hai tín hiệu có diện tích tích phân lần lƣợt là 0,34, 0,32 đây là 2 proton của stigmasterol. Quy đổi diện tích tích phân cho cả 2 proton này là bằng nhau và bằng 0,33.

Tại 5,35 ppm (2H, d, -CH=, H-6 & H-6’) và 3,52 ppm (2H, m, >CH-OH, H-3 & H-3’) đều có diện tích tích phân là 1,0; trong đó H-6 và H-3 là 2 proton của stigmasterol, H- 6’ và H-3’ là 2 proton của β-sitosterol.

Vậy hợp chất HC-A là một hỗn hợp stigmasterol (stigmast-5,22-dien-3β-ol) và β- sitosterol (stigmast-5-en-3β-ol) với tỷ lệ (1:2). Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất đƣợc trình bày trong Hình 3.1.

Hình 3.1. Stigmast-5,22-dien-3β-ol và stigmast-5-en-3β-ol (HC-A).

Bảng 3.1. So sánh tín hiệu stigmasterol & β-sitosterol và HC-A (CDCl3) Số

carbon

Kiểu C-H

13C-NMR δ (ppm) 1H-NMR δ (ppm)

Tài liệu HC-A Tài liệu HC-A

1 37,15 37,29 2 31,56 31,87 3 >CH-OH 71,71 71,81 3,51; m 3,52; m 4 42,19 42,33 5 140,81 140,78 6 -CH= 121,62 121,68 5,3; brd 5,35; brd 7 31,56 31,69 8 31,79 31,91 9 50,02 50,21 10 36,16 36,54 11 21,12 21,09

26

Bảng 3.1. So sánh tín hiệu stigmasterol & β-sitosterol và HC-A (CDCl3) (tiếp theo) Số carbon Kiểu C-H 13C-NMR δ (ppm) 1H-NMR δ (ppm)

Tài liệu HC-A Tài liệu HC-A

12 39,57 39,71 13 42,1 42,24 14 56,76 56,9 15 24,27 24,37 16 28,83 28,89 17 55,84 56,01 18 -CH3 12,15 12,05 1,03; s 1,01; s 19 -CH3 19,88 19,39 0,71; s 0,68; s 20 40,4-40,51 40.44 21 -CH3 20,99 21,05 0,9; d 0,92; d 22’ -CH=C< 138,23 138,28 4,98; m 5,02; m 23’ -CH=C< 129,16-129,6 129,33 5,14; m 5,16; m 24 51,13-51,3 51,25 25 31,94 31,93 26 -CH3 21,23 21,21 0,8; d 0.83; d 27 -CH3 19,01 18,99 0,82; d 0,84; d 28 25,4-25,5 25,38 29 -CH3 12,25-25,3 12,21 3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất HC-B

Thông tin chung:

Hợp chất 2 (HC-B) thu đƣợc khi sắc ký cột phân đoạn cao HTC-HC5 có các đặc điểm sau:

 Chất dạng bột màu trắng kết tinh trong chloroform.

 Sắc ký lớp mỏng hệ dung môi HEX:EA (8:2) cho một vết màu hồng có Rf = 0,26.

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (Phụ lục 3), δ ppm: 5,28 ppm (1H, t, J = 3.5 Hz, >C=CH- ); 3,22 ppm (1H, dd, J = 4 Hz & J = 11 Hz, HO-CH<); 2,82 ppm (1H, dd, J =

27

4 Hz & J = 14 Hz, >C=C-CH-); 1,13; 0,99; 0,93; 0,92; 0,90; 0,78; 0,76 ppm (21H, s, 7-CH3).

Phổ 13C-NMR (500 MHz, CDCl3) (Phụ lục 4), δ ppm: 182,87 ppm (>C=O); 143.62 ppm (>C=C); 122,67 ppm (-CH=); 79,07 ppm (>C-OH).

Phổ MS-CI-possitive (Phụ lục 5) cho thấy mũi ion [M+H] + =457,3; mũi cơ bản [M- 17] + = 439,2 g/mol.

Biện luận cấu trúc:

Sắc ký lớp mỏng hợp chất HC-B cho một vết màu hồng khi hiện hình TLC với H2SO4 40% và chất không hấp thu UV 365 và 254 nm nên hợp chất HC-B có thể là một ster- oid hoặc triterpenoid.

Phổ 13C-NMR có 30 tín hiệu cho thấy hợp chất HC-B có 30 carbon, có 2 mũi tại δ ppm: 143,67; 122,67; đây là vùng cộng hƣởng của các carbon olefin. Tín hiệu tại 79,07 ppm là tín hiệu của carbon nối với nguyên tử có độ âm điện lớn. Tín hiệu tại 182,87 ppm là tín hiệu đặc trƣng của carbon >C=O.

Từ các tín hiệu mũi thu đƣợc trong phổ 1H, 13C-NMR kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [27] trong Bảng 3.2, kết luận HC-B là một triterpenoid có khung olean.

Phổ MS có mũi tại m/z = 439,2 ([M-17] +) và 457,3 ([M+H] +) là phân mảnh và ion phân tử của acid oleanolic (3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid) có công thức C30H48O3 (M = 456,3 g/mol). Các số liệu thực nghiệm tƣơng đồng với số liệu đƣợc công bố trong tài liệu tham khảo nên có thể kết luận hợp chất HC-B là oleanolic acid (3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid) (Hình 3.2).

28

Bảng 3.2. So sánh tín hiệu 3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid và HC-B (CDCl3) Số

carbon

Kiểu C-H

13C-NMR δ ppm 1H-NMR δ (ppm) J (Hz)

Tài liệu HC-B Tài liệu HC-B

1 38,4 38,45 2 27,21 27,22 3 >CH-OH 79,01 79,07 3,22; dd; 12; 4,3 Hz 3,22; dd; 11; 4 Hz 4 38,85 38,79 5 55,25 55,27 6 18,32 18,33 7 32,66 33,07 8 39,28 39,32 9 47,65 47,68 10 37,22 37,13 11 23,4 23,59 12 -CH=C< 122,7 122,67 5,30; t; 3,6 Hz 5,28; m 13 143,53 143,62 14 41,78 41,65 15 27,69 27,73 16 23,04 23,43 17 46,44 46,55 18 =C-CαH- 41,18 41,06 2,83; dd; 13,9; 4,1 Hz 2,82; dd; 14; 4 Hz 19 45,91 45,93 20 30,68 30,69 21 33,82 33,84 22 32,41 32,48 23 -CH3 28,07 28,13 0,99; s 0,99; s