1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cây An Xoa (Helicteres hirsutar L.) đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học bởi nhóm tác giả đến từ Đại học Sƣ Phạm Hà Nội [18] cho thấy sự hiện diện của 12 hợp chất tự nhiên: 3β-O-trans-caffeoylbetulinic acid (34), 3β-benzoylbetulinic acid (41), betulinic acid methyl ester (42), betulinic acid (29), lupeol (43), 4-hydroxybenzoic acid (93), (3,4-dihydroxybenzoic acid methyl ester) (94), 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid
(95), (5,8-dihydroxy-7,4’-dimethoxyflavone) (79), isoscutellarein 4’-methyl ether 8-O- β-D-glucopyranoside (81), methyl caffeate (55), stigmasterol (9). Thử nghiệm hoạt tính gây độc các dòng tế bào nhƣ SK-LU-1, HepG2, Hela, SK-Mel-2, AGS, kết quả đƣợc thể hiện qua Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất
Hợp chất
IC50 (μg/mL)
SK-LU-1 Hep-G2 Hela SK-Mel-2 AGS
34 65,36±2,59 54,58 ± 2,01 58,23 ± 5,73 46,03 ± 3,17 67,10 ± 4,32
42 60,84 ± 4,68 77,43 ± 7,13 80,17 ± 3,80 66,17 ± 3,82 69,94 ± 6,77
29 57,77 ± 3,24 56,22 ± 4,00 67,88 ± 6,50 72,59 ± 4,02 53,50 ± 4,91
43 76,67 ± 6,43 76,17 ± 5,55 73,39 ± 4,95 64,84 ± 6,08 64,23 ± 5,79
79 83,57 ± 6,63 96,06 ± 4,22 70,94 ± 7,59 99,31 ± 5,03 74,95 ± 2,69
Cây An Xoa (Helicteres hirsutar L) thu hái tại Xã Hòn Sơn, Huyện Kiên Hải, Tỉnh Kiên Giang đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc dòng tế bào Hep-G2 [19]. Thử nghiệm hoạt tính, 4 mẫu cao: petroleum ether, dichloromethane, ethyl acetate, methanol đƣợc thử hoạt tính gây độc cho dòng tế bào Hep-G2 pha trong DMSO. Trong đó 2 mẫu cao có thể hiện hoạt tính ở nồng độ 40 μg/mL là cao PE và DC. Giá trị CS% cho biết khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của cao thử tính theo phần trăm so với đối chứng. Cao PE và cao DC tiếp tục đƣợc thử nghiệm cho
9
giá trị IC50 lần lƣợt của 2 loại cao trên là 28,29 μg/mL và 30,30 μg/mL. Kết quả thử nghiệm hoạt tính đƣợc tóm tắt trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào dòng Hep-G2
Stt Ký hiệu mẫu cao Nồng độ đầu (μg/mL) CS% Nhận xét
Mẫu chứng (+) 5 2,55±1,5
1 PHUOC-D1 (Cao PE) 40 0 Dƣơng tính
2 PHUOC-D2 (Cao DC) 40 0 Dƣơng tính
3 PHUOC-D3 (Cao EA) 40 93,42±2,0 Âm tính
4 PHUOC-D4 (Cao MeOH) 40 98,79±1,1 Âm tính
Từ 8 g cao dichloromethane, nhóm tác giả đã cô lập đƣợc 4 hợp chất, sử dụng các phƣơng pháp phổ nghiệm cùng với so sánh tài liệu tham khảo, các hợp chất đƣợc nhận danh là stigmasterol 11 mg (9), lupeol 7 mg (43), apigenin 3 mg (76) và tiliroside 7 mg (72). Kết quả đƣợc tóm tắt trong Bảng 1.3.
Bảng 1.3. Tóm tắt kết quả cô lập các hợp chất từ cây An Xoa thu hái tại Hòn Sơn
Hợp chất 9 43 76 72 Phân đoạn DC2 DC3 DC5 DC8 Kết quả TLC Vết màu tím Rf = 0,26 Vết màu tím Rf = 0,47 Vết màu vàng Rf = 0,38 Vết màu vàng Rf = 0,67
Dung môi PE:EA (9:1) PE:EA (2:1) PE:EA (1:1) EA:MeOH (3:1)
Năm 2018, phần trên mặt đất của cây An Xoa thu hái tại tỉnh Bình Dƣơng đƣợc nhóm tác giả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thƣ [20]. Theo đó, nhóm tác giả đã phân lập đƣợc 6 hợp chất 3β-O-acetylbetulinic acid
(40), simiarenol (44), (4,4’-sulfinylbis(2-(tert-butyl)-5-methylphenol) (90), 7-O- methylisoscutellarein (82), (7,4’-di-O-methyisoscutellarein) (83), hỗn hợp stigmasterol
10
dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời: CCRF-CEM, MDA-MB-231, HCT116, U251, trong đó 2 hợp chất 3β-O-acetylbetulinic acid và 4,4’-sulfinylbis(2-(tert-butyl)-5-methylphenol) có hoạt tính trung bình trên hai dòng tế bào là CCRF-CEM và HCT116, với giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 14.6 đến 31.5 μM.
Nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của các phân đoạn cao chiết từ thân cây An Xoa thu hái tại Lộc Ninh, Bình Phƣớc do Nguyễn Văn Thủy thực hiện vào năm 2017 cho thấy: trong thân cây An Xoa chứa nhiều họ hợp chất tự nhiên, hàm lƣợng phenolic tổng trong cao dichloroethane là 30,34 μgGAE/mg, trong cao n-hexane là 24,737 μgGAE/mg. Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của 2 loại cao này lần lƣợt là 468,92 μg/mL và 432,11 μg/mL [21].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Thân cây An Xoa (Helicteres hirsutar L.) thu hái tại Gunung Kancana, Cianjur, West Java, Indonesia đã đƣợc tác giả Young-Won Chin cùng các cộng sự nghiên cứu, công bố kết quả vào năm 2006[22]. Từ 55,4 g cao MeOH thân cây, nhóm nghiên cứu đã cô lập đƣợc 6 hợp chất lignan: (±)-pinoresinol 5,4 mg (63), (±)-medioresinol 2,1 mg (64), (±)-syringaresinol 3,3 mg (65), (−)-boehmenan 1,4 mg (67), (−)-boehmenan H 0,5 mg
(68), (±)-trans-dihydrodiconiferyl alcohol 4,4 mg (69). Sau đó, các hợp chất tinh khiết đƣợc thử hoạt tính gây độc một số dòng tế bàonhƣ: Lu1, LNCaP, MCF-7, HUVEC, giá trị ED50 đƣợc trình bày trong Bảng 1.4. Các hợp chất (63, 67, 68) thể hiện hoạt tính gây độc các dòng tế bào với nồng độ dƣới 10 μg/mL, còn các hợp chất khác có giá trị ED50 đều lớn hơn 10 μg/mL.
Bảng 1.4. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất tinh khiết đƣợc cô lập từ cây
Helicteres hirsuta L.
Hợp chất ED50 ( g/mL)
Lu1 LNCaP MCF-7 HUVEC
(±)-Pinoresinol 0,8 0,5 1,7 1,1
(-)-Boehmenan 10,4 9,5 10,0 9,0
(-)-Boehmenam H 5,3 7,7 10,2 6,2 Paclitaxel 0,002 0,001 0,006 0,008
11
Vào năm 2017, nhóm tác giả dẫn đầu bởi Hong Ngoc Thuy Pham đã nghiên cứu tối ƣu điều kiện chiết tách flavonoid trong thân và lá cây An Xoa H. hirsuta thu hái tại Nha Trang, Khánh Hòa [23]. Theo đó, tỷ lệ mẫu và dung môi có ảnh hƣởng lớn nhất đến các hoạt chất sinh học và khả năng kháng oxy hóa của loài H. hirsuta, nghiên cứu cũng đƣa ra điều kiện tối ƣu để chiết tách là nhiệt độ 60 °C, thời gian 35 phút, tỷ lệ mẫu dung môi là 1 : 100 g / mL, dung môi MeOH : nƣớc 40% (v:v), khi đó, hàm lƣợng phenolic tổng là 16,87 mg GAE/g, và hàm lƣợng flavonoid tổng là 17,55 mgCE/g.
Cấu trúc các steroid cô lập từ chi Helicteres
Steroid là nhóm các hợp chất tự nhiên đƣợc chuyển hóa từ cấu trúc vòng cyclopenta- noperhydrophenantren [24] Hình 1.2. (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16)
12
Cấu trúc các triterpenoid cô lập từ chi Helicteres
Các hợp chất triterpenoid là những hợp chất phân bố rộng rãi trong giới thực vật và động vật, những triterpenoid cô lập từ chi Helicteres có khung sƣờn carbon là olean (5 hợp chất), lupan (22 hợp chất) và adian (simiarenol) đƣợc trình bày trong Hình 1.3.
(17-21) R1 = H, R2 = benzoyloxy, R3 = CH3, (17) R1 = O-(p-hydroxy -(E)-cinnamoyl), R2 = R3 = H, (18) R1 = R2 = R3 = H, (19) R1 = acetyl,R2 = 4-hydroxybenzoyl, R3 = CH3, (20) R1 = acetyl, R2 = benzoyl, R3 = CH3, (21) (22-43) Simiarenol (44) R1 = H, R2 = benzoyloxy, R3 = COOH, (22) R1 = H, R2 = benzoyloxy, R3 = COOCH3, (23)
R1 = acetyl, R2 = benzoyloxy, R3 = COOH, (24)
R1 = acetyl, R2 = benzoyloxy, R3 = COOCH3, (25)
R1 = acetyl, R2 = 4-hydroxybenzoyloxy, R3 = COOCH3, (26)
R1 = acetyl, R2 = H, R3 = CH2OH, (27)
R1 = caffeoyl, R2 = H, R3 = COOH, (28)
R1 = R2= H, R3=COOH, (29)
R1 = acetyl, R2 = O-(trans-cinnamoyl, R3 = COOCH3, (30)
R1 = acetyl, R2 = 4-hydroxybenzoyl, R3 = COOH,
(31)
R1 = H, R2 = OH, R3 = COOH, (32)
R1 = trans-coumaroyl, R2 = R3 =H, (33)
R1 = trans-caffeoyl, R2 = R3 =H, (34)
R1 = trans-feruloyl, R2 = R3 =H, (35)
R1 = trans-coumaroyl, R2 = H, R3 = CH2OH, (36)
R1 = cis-coumaroyl, R2 = H, R3 = CH2OH, (37)
R1 = trans-caffeoyl, R2 = H, R3 = CH2OH, (38)
R1 = trans-feruloyl, R2 = H, R3 = CH2OH, (39)
R1 = acetyl, R2= H, R3 = COOH, (40)
R1 = benzoyloxy, R2= H, R3 = COOH, (41)
R1 = R2= H, R3=COOCH3, (42)
R1 = R2= H, R3=CH3, (43)
13
Cấu trúc các ketone cô lập từ chi Helicteres.
Nhƣ đã nhắc đến ở phần trƣớc, hầu hết các hợp chất ketone cô lập từ chi Helicteres có khung mansonone (45-48), cùng với các hợp chất khác đƣợc trình bày trong Hình 1.4.
R = H, (45) R = OH, (46) R = OCH3, (47)
(48) (49)
(50) (51)
Hình 1.4. Một số ketone cô lập từ Helicteres
Các hợp chất lignan và phenylpropanoid cô lập từ chi Helicteres
Phenylpropanoid là nhóm hợp chất tự nhiên có sƣờn carbon cơ bản phenylpropane (C6-C3) có thêm các nhóm thế hydroxy, methoxy trong phần C6 hoặc một số nhóm định chức khác trong phần C3. Nhóm hợp chất này đƣợc chia thành nhiều nhóm khác nhƣ: nhóm trực tiếp (thành phần các loại tinh dầu trong thực vật), nhóm đƣợc ester hóa, nhóm đóng vòng (hợp chất coumarine), và nhóm các hợp chất lignan.
Lignan là hợp chất khi hai đơn vị phenylpropanoid kết hợp với nhau qua một nối car- bon-carbon trên mạch nhánh của hai đơn vị phenylpropanoid tạo thành, nếu nối car- bon-carbon đƣợc tạo thành bởi bất kỳ carbon nào của hai đơn vị phenylpropanoid đƣợc gọi là neolignan [24].
Các hợp chất lignan có hoạt tính sinh học đa dạng, nhiều hợp chất thuộc nhóm này có khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thƣ. Cấu trúc các hợp chất lignan và phenyl- propanoid cô lập từ chi Helicteres đƣợc trình bày tóm tắt trong Hình 1.5.
14
Hình 1.5. Cấu trúc hợp chất lignan và phenyl pronanoid cô lập từ chi Helicteres
(52) (53) (54) (55) (56) (57-58) (7’) α-H, (57) (7’) β-H, (58) (60-63) R1 = H, R2 = OH, R3 = H, (59) R1 = H, R2 = OH, R3 = β-D-Glc, (60) R1 = β-D-Glc, R2 = OH, R3 = β-D-Glc, (61) R1 = H, R2 = H, R3 = β-D-Glc, (62) (63-66) R1 = R4 = OMe, R2 = R3 = H, R5 = R6 = OH, (63) R1 = R2 = R4 =OMe, R3 = H, R5 = R6 = OH, (64) R1 = R2 = R3 = R4 = OMe, R5 = R6 = OH, (65) R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = R6 = OMe, (66) (67-70) R1 = R2 = feruloyl, R3 = H, (67) R1 = feruloyl, R2 = R3 = H, (68) R1 = R2 = R3 = H, (69) R1 = R2 = H, R3 = β-D-Glc, (70)
15
Các hợp chất flavonoid cô lập từ chi Helicteres
Ngoài sự đa dạng về các thành phần triterpenoid, lignan thì thành phần hóa học của chi
Helicteres cũng rất đa dạng về thành phần flavonoid. Flavonoid có khung sƣờn là 1,3- diphenylpropane [24] nên việc xếp những hợp chất này vào nhóm polyphenol sẽ không thể hiện rõ sự khác biệt này. Những hợp chất họ flavonoid đƣợc khai thác do có tiềm năng kháng oxy hóa (trung hòa các gốc tự do) [16]. Nhƣ đã nhắc đến ở phần trƣớc, cấu trúc các flavonoid đã cô lập từ chi Helicteres đƣợc trình bày trong Hình1.6.
(72-77) R1 = R3 = H, R2 =β-D-Glc,R4 = OH, (71) R1 = R3 = H, R2 = (6-O-p-coumaroyl)Glc, R4 = OH, (72) R1 = R3 = H, R2 = R4 = OH, (73) R1 = R3 = OH, R2 = H, R4 = OCH3, (74) R2 = R3 = OH, R1 = H, R4 = OCH3, (75) R1 = R3 = R2 = H, R4 = OH, (76) (78-79) R1 = (6-O-rhamnosyl)Glc, R2 = H, R3 = CH3, (77) R1 = β-D-Glc, R2 = CH3, R3 = H, (78) (80-84) R1 = OCH3, R2 = H, R3 = H, R4 = OCH3, (79)
R1 = OH, R2 = β-D-Glc, R3 = OH, R4 = OCH3, (80)
R1 = OH, R2 = β-D-Glc, R3 = H, R4 = OCH3, (81) R1 = OCH3, R2 = H, R3 = H, R4 = OH, (82) R1 = OCH3, R2 = H, R3 = H, R4 = OCH3, (83) (84-88) R1 =CH3, R2 = R3 = R4 =H, (84) R1 =CH3, R2 = R3 = H, R4 = n-Bu, (85) R1 =CH3, R2 = SO3-, R3 = R4 = H, (86) R1 =CH3, R2 = R3 = SO3-, R4 = H, (87) R1 =H, R2 = R3 = SO3-, R4 = H, (88)
16
Các hợp chất khác cô lập từ chi Helicteres
Ngoài các hợp chất thuộc các họ steroid, terpenoid,... còn có một số hợp chất khác cũng đƣợc cô lập từ chi Helicteres nhƣ alkaloid (một nhóm hợp chất có tính base, cấu trúc thƣờng có nguyên tử nitrogen đƣợc sinh tổng hợp từ các amino acid [24]). Ngoài ra, các hợp chất phenol đơn vòng cũng hiện diện trong thành phần hóa học của các loài thuộc chi Helicteres, cấu trúc các hợp chất này đƣợc trình bày trong Hình 1.7.
(89) (90)
(91-96)
R1 = R2= OMe, R3 = O-α-L-rhamnosyl, R4 = COOH, (91)
R1= H, R2= R3= OH, R4= COOH, (92)
R1=R2= H, R3 =OH, R4= COOH, (93)
R1= H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = COOMe, (94)
R1=R2= OMe, R3 = OH, R4 = COOH, (95)
R1= H, R2= R3= OH, R4= CHO, (96)
17
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hóa chất thiết bị
Hóa chất:
Dung môi: ethanol 96° (Hóa Nam), methanol, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone (Chemsol).
Hóa chất khác: sulfuric acid (98%, Trung Quốc), silica gel (200-400 mesh, Ấn Độ).
Thiết bị:
Máy cô quay chân không (Yamato), Đèn UV 254- 365 nm,
Cân phân tích (Precisa) Tủ sấy đối lƣu
Khuấy từ gia nhiệt Tủ hút khí độc (Esco) Bể điều nhiệt (Sinosource)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) đƣợc ghi trên máy Bruker Advance 500 tại Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Khối phổ đƣợc đo trên máy Agilient LC-MS tại Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Dụng cụ: beaker (250, 500 mL), phễu thủy tinh (Φ5, 20 cm), bình cầu (100, 500 mL), erlen (125 mL), cột sắc ký (Φ2, 5, 10 cm), hủ bi (5, 10 mL). Sắc ký lớp mỏng loại tráng sẵn silica gel pha thƣờng, kích cỡ 20×20 cm, Merck.
Nơi tiến hành luận văn: Phòng thí nghiệm hữu cơ B109, Khoa Công nghệ Hóa học
và Thực phẩm, Trƣờng đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật, số 01 Võ Văn Ngân, Phƣờng Linh Chiểu, Quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh.
18
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp trích ly
Đề tài chọn phƣơng pháp ngâm dầm bột cây ở nhiệt độ phòng để trích ly các hợp chất ra khỏi bột cây và phƣơng pháp chiết pha rắn trên silica gel để phân loại cao theo độ phân cực tăng dần.
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm độ tinh khiết
Sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng có chiều cao 5 cm, bề rộng tùy thuộc vào số lƣợng mẫu cần kiểm tra, pha động là hệ dung môi đƣợc lựa chọn cho phù hợp với mỗi loại cao, mỗi loại chất dựa vào độ phân cực của mẫu.
Cụ thể, mẫu cao có độ phân cực thấp sẽ đƣợc giải ly với hệ dung môi HEX:EA để dò tìm tỷ lệ sao cho các vết trải đều trong đoạn từ vạch tiền tuyến đến vạch xuất phát dung môi, các mẫu có độ phân cực mạnh thì sẽ đƣợc giải ly trong hệ dung môi CH:MeOH. Sau đó, TLC đƣợc hiện hình bằng các phƣơng pháp vật lý, hóa học.
2.2.3. Phương pháp cô lập các hợp chất
Sắc ký cột cổ điển là phƣơng pháp dễ dàng thực hiện với điều kiện phòng thí nghiệm và tối ƣu về kinh tế nên đây là phƣơng pháp chính dùng để nghiên cứu phân lập, tinh chế các hợp chất hữu cơ trong luận văn.
Các bƣớc tiến hành sắc ký cột nhƣ sau:
Cột sắc ký đƣợc làm sạch sấy khô, tráng acetone, lót bông ở trƣớc khóa cột.
Silica gel (khôi lƣợng gấp 10÷20 lần lƣợng mẫu) đƣợc ngâm trong dung môi n- hexane để trƣơng nở (10 phút, đậy kín dụng cụ chứa bằng giấy bạc) trƣớc khi nạp cột.
Thêm lƣợng dung môi đến 1/2 chiều cao cột
Mở khóa cột và cho lƣợng chất hấp phụ đã trƣơng nở lên cột, để chất hấp phụ lắng yên rót thêm dung môi vào xả cột để cột ổn định (30 phút).
Sau khi dung môi cách phần chất hấp phụ 0.5 cm, tiến hành nạp mẫu.
Chuẩn bị mẫu: do mẫu khó tan trong dung môi nạp cột nên phƣơng pháp nạp mẫu khô đƣợc lựa chọn. Mẫu chất đƣợc làm khô bằng máy cô quay chân không (tốc độ quay:
19
80 vòng/ phút, nhiệt độ bể: 55 °C, áp suất 250÷300 hPa), và trộn với silica gel lần lƣợt từng lƣợng nhỏ để tơi hoàn toàn.
2.2.4. Phương pháp nhận danh và giải đoán cấu trúc
Vận dụng kết hợp các phƣơng pháp phổ nghiệm một chiều (1H, 13C-NMR, DEPT), hai chiều (HSQC, HMBC) và phổ khối MS cùng với so sánh các tài liệu tham khảo để giải đoán cấu trúc và nhận danh các hợp chất hữu cơ đã cô lập.
2.3. Xử lý nguyên liệu
Cây An Xoa (Helicteres hirsuta L.) đƣợc thu hái tại Xã Bù Nho, Huyện Phƣớc Long, Tỉnh Bình Phƣớc. Cây đƣợc định danh bởi TS. Nguyễn Hữu Trí, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phần thân và lá đƣợc rửa sạch tách riêng, sấy ở nhiệt độ 70 °C cho đến khi khối lƣợng không đổi. Thân và lá đƣợc xay nhuyễn thành bột mịn để thực hiện nghiên cứu.
2.4. Điều chế cao tổng
Cao tổng ethanol đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp ngâm dầm bột cây (bột thân 1,3 kg, bột lá 1,5 kg) với dung môi ethanol 96° trong bình thủy tinh dung tích 25 L trong 24 giờ, dịch trích ly đƣợc lọc qua giấy lọc nhanh loại bỏ cặn, tạp bẩn dạng hạt.
Dịch lọc đƣợc mang đi cô quay thu hồi dung môi, phần cao còn lại trong bình cô quay đƣợc chuyển ra beaker 250 mL để trên bể điều nhiệt 60 °C để bay hết dung môi. Thực hiện quá trình liên tục trong vòng 30 ngày thu đƣợc cao ethanol tổng của phần thân và lá.
2.5. Điều chế cao phân đoạn từ cao ethanol
Cao phân đoạn đƣợc điều chế bằng cách chiết pha rắn cao ethanol bằng cột nhồi silica gel. Lƣợng cao tổng sau khi làm khô đƣợc trộn với silica gel tỷ lệ 2 : 3 (mcao : msilica gel), đƣợc nạp lên đầu cột (d = 10 cm, msilica gel = 400 g). Tiến hành giải ly bằng các đơn