TLC cao HTC có nhiều vết đậm màu nên đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát. Các phân đoạn khác cho vệt không tách rõ nên sẽ đƣợc khảo sát khi có điều kiện và thời gian.
Bảng 2.2. Thực nghiệm sắc ký cột cao HTC
Ký hiệu Thứ tự hủ bi Hệ dung môi Khối lƣợng (g)
- 1-10 HEX - HC1 11-38 HEX:EA (9:1) 2,00 HC2 39-59 HEX:EA (9:1) 0,75 HC3 60-92 HEX:EA (8:2) 1,46 HC4 93-107 HEX:EA (8:2) 1,43 HC5 108-137 HEX:EA (8:2) 0,50 HC6 138-167 MeOH 0,30 Tổng (g) 6,14 Thu suất (%) 76,76
Cao HTC đƣợc chia làm 2 phần: phần thứ nhất (8.39 g) trộn với silica gel (12.5 g) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 5 cm và msilica gel = 250 g), giải ly lần lƣợt với HEX và tăng dần độ phân cực bằng EA, dịch giải ly đƣợc hứng vào các hủ bi thủy tinh dung tích 10
21
mL.Các hủ bi cho cùng kết quả TLC đƣợc gom lại, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột phân đoạn cao HTC đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.2. Phần còn lại của cao HTC đƣợc giữ lƣu mẫu.
Khảo sát phân đoạn HC2
Phân đoạn HC2 có vết chính màu tím khi hiện hình với acid H2SO4 40% nên đƣợc tiếp tục khảo sát. Phân đoạn HC2 (750 mg) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 2 cm, msilica gel = 22,5 g). Cột đƣợc giải ly với hệ dung môi HEX:EA 95:5, tăng dần độ phân cực bằng hệ dung môi HEX:EA 8:2, dịch giải ly đƣợc hứng vào các hủ bi thủy tinh dung tích 10 mL, các hủ bi cho sắc ký lớp mỏng giống nhau đƣợc gom chung, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thực nghiệm sắc ký cột phân đoạn HC2 Ký hiệu Thứ tự hủ bi Hệ dung môi Khối lƣợng (mg) Ghi chú
HC2.1 1-18 HEX:EA (95:5) 320 Khảo sát thu HC-A
HC2.2 19-21 HEX:EA (8:2) 90 Không khảo sát HC2.3 22-27 HEX:EA (8:2) 80 Không khảo sát HC2.4 28-42 HEX:EA (8:2) 45 Không khảo sát
Tổng (mg) 535
Thu suất (%) 71,33
Tinh sạch phân đoạn HC2.1: Phân đoạn HC2.1 (320 mg) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 1 cm, msilica gel = 9,6 g). Cột đƣợc giải ly với dung môi HEX, dịch giải ly hứng vào các hủ bi dung tích 10 mL, các phân đoạn giống nhau đƣợc gom lại, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả hủ bi số 44 đến hủ bi số 48 thu đƣợc chất rắn màu trắng kết tinh (200 mg), các phân đoạn truóc cho kết quả TLC nhiều vết không có vết mục tiêu nên không khảo sát. Chất rắn này tiếp tục đƣợc làm tinh bằng cột sắc ký có d = 1 cm, msili- ca gel = 6 g, giải ly với dung môi HEX, thu đƣợc 3 phân đoạn, trong đó phân đoạn thứ hai (21,2 mg) cho một vết màu tím khi giải ly TLC với hệ dung môi HEX:EA 9:1, phân đoạn này dƣợc đặt tên HC-A, các phân đoạn khác cho vết màu tím kéo dài nên sẽ đƣợc lƣu trữ và khảo sát khi có điều kiện.
22
Khảo sát phân đoạn HC5
Phân đoạn HC5 có vết màu hồng khi hiện hình với acid H2SO4 nên đƣợc tiếp tục khảo sát. Phân đoạn HC5 (500 mg) đƣợc nạp lên đầu cột (d = 2 cm, msilica gel = 15 g). Cột đƣợc giải ly với hệ dung môi HEX:EA 95:5, tăng dần độ phân cực bằng hệ dung môi HEX:EA 9:1, dịch giải ly đƣợc hứng vào các hủ bi thủy tinh dung tích 10 mL, các hủ bi cho kết quả TLC giống nhau đƣợc gom chung, cô quay thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.4. Phân đoạn HC5.5 (60.5 mg) đƣợc hòa tan trong dung môi HEX:EtOH (98:2) tối thiểu, nhiệt độ 40 °C, khi chất rắn đã tan hoàn toàn, tắt gia nhiệt để cho các tinh thể kết tinh ở nhiệt độ phòng 23÷30 °C, hút bỏ phần dịch thu phần kết tinh (17,5 mg), phần kết tinh đƣợc kiểm tra bằng TLC, kết quả cho một vết màu hồng với hệ dung môi HEX:EA 8:2. Chất rắn sau khi tinh sạch đƣợc đặt tên là HC-B.
Bảng 2.4. Thực nghiệm sắc ký cột phân đoạn HC5 Ký hiệu Thứ tự hủ bi Hệ dung môi Khối lƣợng (mg) Ghi chú
HC5.1 1-6 HEX:EA (95:5) 7,7 Không khảo sát HC5.2 7-18 HEX:EA (9:1) 265,4 Không khảo sát HC5.3 19-36 HEX:EA (9:1) 9,2 Không khảo sát HC5.4 40-44 HEX:EA (9:1) 22,8 Không khảo sát HC5.5 45-51 HEX:EA (9:1) 60,5 Khảo sát thu HC-B
Tổng (mg) 365,6
Thu suất(%) 73,08